不同核酸提取試劑盒在新型冠狀病毒核酸檢測中的比較研究

馬雯 張偉宏 馬瑛龍 葸靜 金哲宇，5 樸文花★

新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV）引起的肺炎廣泛傳播，并在全球蔓延。國際病毒分類協(xié)會將其命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2），隨后世界衛(wèi)生組織公布其基因組序列，并將該病毒導致的疾病命名為COVID-19（Corona Virus Disease 2019）[1-2]。國家衛(wèi)生健康委多次印發(fā)新型冠狀病毒肺炎診療方案，始終將逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Reverse Transcription Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）檢測新型冠狀病毒的核酸作為確診及治療監(jiān)測的重要指標[3]。現(xiàn)已注冊的新冠病毒核酸檢測試劑多以開放閱讀框架1ab（Open Reading Frame 1ab，ORF1ab）基因、核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）基因及包膜蛋白（Envelope，E）基因為檢測對象，同時攜帶內(nèi)源性內(nèi)標（Internal Control，IC）基因，實現(xiàn)對新型冠狀病毒的核酸檢測[4]。有醫(yī)院發(fā)現(xiàn)新冠核酸檢測結果存在假陰性較高，與臨床癥狀不相符，不同廠家檢測試劑盒結果不一致等問題[5-6]。影響新冠病毒核酸檢測結果的因素很多，盡管多數(shù)實驗室都在關注檢測試劑的性能，但實際上，核酸純度及濃度在RT-qPCR 檢測過程中也十分重要，因此基于目前所出現(xiàn)的問題，本實驗室通過收集6種新型冠狀病毒核酸提取試劑盒的基本情況，比較其核酸提取效果及RT-qPCR擴增結果等參數(shù)，綜合分析試劑盒的性能，為使用者合理選擇試劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2020年2月15日至2020年2月29日就診本院發(fā)熱門診的20例疑似新型冠狀病毒感染者的鼻咽部拭子作為標本，按照規(guī)定轉(zhuǎn)運至分子生物學實驗室立即檢測，檢測前置于65℃水浴滅活20 min。

1.2 實驗方法

使用RT-qPCR擴增新型冠狀病毒核酸。所有檢測嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（國衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）[7]、《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于印發(fā)新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）的通知》（國衛(wèi)辦科教函〔2020〕70號）[8]及《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第四版）》（國衛(wèi)辦疾控函〔2020〕109號）[9]相關文件進行實驗操作和生物安全防護。

1.3 儀器與試劑

核酸提取使用杭州奧盛K30型干浴儀高溫干浴，離心使用安徽嘉文JW-2018H 高速冷凍離心機；提取的核酸使用NanoDrop One 微紫外/可見分光光度計測量核酸濃度、核酸純度，檢測前使用各試劑盒中提供的洗脫液作空白對照；新型冠狀病毒基因擴增使用ABI 7500 實時熒光定量PCR儀，檢測試劑使用中山大學達安基因提供的新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（批號：2020017），設置熒光檢測通道及反應程序，按照說明書要求，當N基因、ORF1ab基因及IC基因的擴增通道出現(xiàn)明顯的S型曲線，且Ct值均≤40，可判定為陽性結果。

選擇已獲得國家藥監(jiān)局批準的可用于新型冠狀病毒核酸提取純化的試劑盒，并對試劑盒隨機編號為A（中山大學達安基因股份有限公司，批號為2020003）、B（圣湘生物科技股份有限公司，批號為2020002）、C（上海之江生物科技股份有限公司，批號為P20200101）、D（上海科華生物工程股份有限公司，批號為20026530）、E（江蘇碩世生物科技股份有限公司，批號為20200110）、F（羅氏診斷有限公司，批號為43556600）。

4個陽性標本提取的核酸使用各公司試劑盒內(nèi)提供的洗脫液按照1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200的稀釋度倍比稀釋，立即進行RT-qPCR擴增。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0軟件。計量資料用（）表示組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)使用多元方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。圖表使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件繪制。

2 結果

2.1 核酸提取試劑盒的基本情況

6種新冠病毒核酸提取試劑盒的基本情況見表1。

表1 核酸提取試劑盒基本情況表Table1 Baseline data of 2019-nCoV extraction kits

2.2 核酸濃度及純度的比較

不同試劑盒所提取的核酸在濃度方面比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果為A＞F＞D＞B＞E＞C。核酸純度中最高檢測值為A試劑盒，剩下依次為E、D、F、C、B，6種試劑盒之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見表2。

表2 核酸濃度及純度的比較（±s）Table2 Comparison of total RNA concentration and purity（±s）

表2 核酸濃度及純度的比較（±s）Table2 Comparison of total RNA concentration and purity（±s）

試劑盒ABCDEF P值n 20 20 20 20 20 20核酸濃度（ng/μL）75.499±13.565 6.827±1.925 2.252±0.965 15.912±3.038 6.548±2.151 46.666±13.404＜0.001核酸純度2.802±0.244 1.815±0.108 1.826±0.446 2.347±0.405 2.705±0.414 1.978±0.214＜0.001

2.3 擴增結果分析

RT-qPCR擴增結果顯示，6種試劑盒所提核酸均能檢出4份標本的N基因、ORF1ab基因及IC基因（Ct值≤40），可判定為陽性。其他16份標本只有IC基因可檢出，判定為陰性。

分析擴增后IC基因的Ct值及△Rn值。F試劑盒提取的總RNA 擴增后的Ct值最小，其次為D試劑、E試劑、B試劑、C試劑和A試劑（見圖1A），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。擴增后得到的熒光曲線中，A試劑的ΔRn值最高，其次為F試劑、E試劑、D試劑、C試劑、B試劑（見圖1B），差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

分析4個陽性標本N基因及ORF1ab基因的擴增數(shù)據(jù)。不同試劑提取的核酸擴增后，N基因中的Ct值A＜D＜E＜F＜B＜C（如圖2A），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。N基因的ΔRn值中，A試劑最高，其次為F試劑、D試劑、C試劑、E試劑及B試劑（如圖2B），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ORF1ab基因Ct值與ΔRn值的比較中，如圖2C、2D，呈現(xiàn)出與N基因相同的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 核酸稀釋后擴增結果的比對

對4個陽性標本稀釋后再擴增。F試劑提取的核酸在1∶3 200 稀釋時可將4個陽性標本的IC基因、N基因、ORF1ab基因均檢出。C試劑提取的核酸在1∶1 600 稀釋時可以檢出3個IC基因，3個N基因及1個ORF1ab基因。其他幾種試劑盒在1∶1 600 稀釋時均有未檢出的基因。統(tǒng)計各試劑所提核酸經(jīng)稀釋后檢出的陽性樣本數(shù)目，如圖3A。4個陽性樣本在不同的稀釋后，3次重復實驗中，F(xiàn)試劑可檢出各稀釋度下所有的陽性樣本，在1∶1 600 的稀釋時C試劑檢出2個陽性樣本，其他幾種試劑均未檢出陽性樣本，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002＜0.05，F(xiàn)=12.82）。分析不同稀釋度擴增后3個基因的Ct值，見如圖3B、3C、3D，F(xiàn)試劑的提取效率最好，擴增曲線的Ct值在1∶800、1∶1 600和1∶3 200 的稀釋度時，均低于其他幾種試劑。

3 討論

RT-qPCR因其靈敏度高、特異性強、操作簡單且耗時短[10]，成為新型冠狀病毒核酸檢測的主要方法。但使用RT-qPCR 檢測新冠病毒出現(xiàn)假陰性率高、檢測結果與臨床癥狀不吻合等報道，備受關注[5-6]。在影響新冠病毒核酸檢測結果的眾多因素中，高質(zhì)量、高純度核酸是檢測成功的必備條件。本次所選核酸提取試劑盒均為手工提取，包括膜吸附柱法、磁珠柱法和磁珠法。膜吸附柱法耗時長，但穩(wěn)定性好，重復性高。磁珠法操作方便，用時少，價格低廉[11]，二者相比各有所長。對提取出的總RNA 分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)試劑盒提取出的核酸品質(zhì)最高。C試劑盒提取出的核酸純度雖符合要求，但濃度偏低，分析可能與其標本起始量過低相關。試劑盒A 提取的核酸雖然濃度高，但其核酸純度不理想。質(zhì)量較好的RNA 純度A260/A280 比值應在1.8～2.0 之間，比值小于1.8 時，提示溶液中可能存在蛋白質(zhì)或酚類的污染；大于2.0 時，或因RNA或已水解成單核苷酸導致，另一方面現(xiàn)有核酸提取試劑多使用異硫氰酸胍，其殘留也會增加A260/A280 的比值。

Ct值為熒光信號達到閾值時所需的循環(huán)數(shù)，它與起始模板的濃度負相關，可以代表PCR 的擴增效率。ΔRn值是熒光PCR 在扣除背景信號后的熒光值，能反映擴增產(chǎn)物的數(shù)量。Ct值與ΔRn值的差異顯示不同核酸提取試劑盒對新冠病毒核酸檢測結果會產(chǎn)生影響。按比例對陽性標本的核酸進行稀釋，并進行擴增分析，F(xiàn)試劑檢出陽性樣本數(shù)量最多，其次為C試劑，6種試劑盒相比差異明顯。由此可見，核酸的濃度及純度對新型冠狀病毒核酸檢測的結果有直接且顯著的影響。

在新冠肺炎核酸檢測方面各家實驗室對試劑盒的評價不一致[12-13]，一方面可能是各試劑盒上市倉促，質(zhì)量和性能有待優(yōu)化，另一方面也與實驗室條件、操作人員檢測經(jīng)驗、操作水平相關。本實驗通過檢測20例標本結果比對認為，市售的6種核酸提取試劑盒中，F(xiàn)試劑盒在提取效果及陽性標本的檢出率方面均優(yōu)于其他5種試劑盒，但其成本較高，常規(guī)實驗室可能無法使用。其他5種試劑成本接近，因此各實驗室可根據(jù)實驗目的，樣本量多少以及實驗室經(jīng)費等情況，選擇適合的新冠病毒核酸提取試劑盒。