3-溴丙酮酸脂質立方液晶的處方篩選及制備工藝優(yōu)化

侯方燕，王海蓉，田 勇，劉 浩，趙軍軍，李見春

3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-BP)，相對分子質量166.96，作用于糖酵解中的關鍵限速酶己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)。作為強大的糖酵解抑制劑，因與體內細胞代謝產物乳酸、丙酮酸結構相似，使其可以借助轉運乳酸、丙酮酸的蛋白如單羧酸轉運蛋白轉運進入腫瘤細胞，可以有效的減少腫瘤細胞內ATP的生成，切斷腫瘤細胞的能量供應，通過餓死腫瘤細胞達到殺死腫瘤細胞的目的[1-7]。但是由于結構簡單及不明確的不良反應，3-BP長期使用安全性等仍需考察，臨床使用仍然受限[8]。因此對3-BP結構改造如形成藥物共聚物[9]，或者使用新型遞藥體系如脂質體[10-11]、金納米顆粒[12]、微膠囊化[13]、微納米脂質[14]等進行抗腫瘤研究，具有較大的意義。

脂質立方液晶納米粒(liquid crystalline nanoparticles,LCNP)是由一定濃度的兩親性脂質分散在水溶液中自發(fā)形成的含雙連續(xù)水區(qū)和脂質區(qū)的閉合脂質雙層蜂窩狀(海綿狀)結構。兩親性脂質一般先自發(fā)形成熱力學穩(wěn)定的脂質雙層，再重組成具有各種形狀和結構的液晶體系，如層狀液晶、立方液晶、六角液晶。立方液晶因其獨特的雙水道結構，可以包載不同極性、粒徑的藥物，使藥物能夠較少的受到機體和免疫系統(tǒng)的影響。立方液晶是自穩(wěn)定體系，穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)的納米粒，而且載體材料安全、無毒、流動性好，可用于靜脈注射等[15-25]。本文針對3-BP所面臨的問題，制備3-BP脂質立方液晶納米制劑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 3-BP(西格瑪有限公司)；甘油單油酸酯(GMO，上海寶曼生物科技有限公司)；泊洛沙姆407(F127，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)；其余試劑均為分析純。LC-15AC型二元高壓梯度高效液相色譜儀(日本島津有限公司)；JN-02HC 高壓均質機(廣州聚能生物科技有限公司)；Nano-ZS90粒度檢測儀(MALVERN INSTRUMENTS LIMITED公司)；Milli-Q Advantage A10型純水機(密理博貿易有限公司)。

1.2 HPLC測定3-BP含量方法學的建立

1.2.1 色譜條件 色譜柱:ZOBARX SB-AQ(4.6×150 mm，5 μm)；流動相：0.1%三氟乙酸-水：0.1%三氟乙酸-乙腈(90∶10，V/V)；流速0.8 mL/min；紫外檢測波長204 nm；進樣量20 μL；柱溫：室溫。

1.2.2 溶液的制備 精密稱取3-BP對照品適量，至10 mL棕色量瓶中，加入適量流動相溶解并稀釋定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的對照品儲備液；精密量取空白LCNP溶液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入適量流動相，超聲10 min，定容至刻度即得空白脂質立方液晶溶液；精密量取3-BP-LCNP溶液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入適量流動相，超聲10 min，定容至刻度即得供試品溶液；以上溶液均用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣。

1.2.3 標準曲線的建立 取對照品儲備液稀釋成5、10、25、50、90、100、250、500、750 μg/mL的對照品溶液，取20 μL進樣，記錄色譜圖，以峰面積(A)對質量濃度(C，μg/mL)進行線性回歸。

1.2.4 專屬性 取上述對照品、供試品及空白脂質立方液晶溶液，進樣并記錄色譜圖，觀察輔料對3-BP的含量測定是否存在干擾。

1.2.5 精密度考察 將3-BP對照品分別配制成10、90、250 μg/mL的低、中、高三種不同濃度的溶液，1 d內重復進樣6次，計算日內精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度，計算其相對標準偏差(RSD)。

1.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份3-BP供試品溶液，室溫條件下分別放置0、2、4、6、8、12、24 h，進樣并記錄峰面積。

1.2.7 回收率考察 將3-BP對照品加入至空白脂質立方液晶中，分別配制成25.3、101.2、253.0 μg/mL的低、中、高三種不同濃度的溶液，每個樣品平行進樣3次，記錄3-BP峰面積。

1.3 包封率及載藥量的考察 本試驗采用透析法測定3-BP-LCNP的包封率。

1.3.1 透析時間考察 精密量取3-BP-LCNP 1 mL至預處理好的透析袋中，室溫下純水作為透析介質，磁力攪拌。分別于第1、2、3、4、5、6、7 h取樣并補足相應的體積，取續(xù)濾液20 μL進樣，記錄3-BP峰面積。

1.3.2 方法回收率 精密量取3-BP對照品溶液，分別配制成低、中、高三種不同濃度的溶液。取1 mL至預處理好的透析袋中，室溫下以200 mL純水作為透析介質，透析4 h。取續(xù)濾液20 μL進樣，記錄3-BP峰面積。

1.3.3 加樣回收率 取3-BP對照品溶液適量，用空白LCNP定容至10 mL，配制成低、中、高三種濃度。取1 mL至預處理好的透析袋中，室溫下以200 mL純水作為透析介質，透析4 h。取續(xù)濾液20 μL進樣，記錄3-BP峰面積。

1.3.4 包封率 精密量取3-BP-LCNP 1 mL至透析袋中，室溫下以純水作為透析介質，透析4 h。取樣品超聲破乳或透析液中游離3-BP續(xù)濾液進樣，測得3-BP峰面積，計算其包封率。載藥量計算公式：載藥量/%=脂質立方液晶中所含藥物重/脂質立方液晶的總重×100%。

1.4 正交試驗篩選及優(yōu)化處方 采用不同比例的處方GMO/F127(9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，wt%)、純水(20、70、80、90，wt%)，利用偏光顯微鏡進行立方液晶處方的初步篩選。采用正交設計L9(34)，以3-BP占GMO比例(Ⅰ ,wt%)、GMO/F127比例(Ⅱ,wt%)、分散相的用量(Ⅲ,mL)、攪拌時間(Ⅳ,min)四因素(見表1)，以包封率為評價指標，篩選3-BP-LCNP最優(yōu)處方。

1.5 3-BP-LCNP制備工藝優(yōu)化

1.5.1 均質壓力 將3-BP-LCNP放入高壓均質機內，均質壓力分別為7 450、7 500、14 900 psi，均質次數固定為9次，收集均質后3-BP-LCNP，測定粒徑及包封率。

1.5.2 均質次數 將3-BP-LCNP放入高壓均質機內，固定壓力為14 900 psi，均質次數為3、6、9次，收集均質后3-BP-LCNP，測定粒徑及包封率。

2 結果

2.1 3-BP含量測定方法學結果 3-BP在5～750 μg/mL內線性關系滿足試驗要求。標準曲線方程：Y=0.046 4X-0.071 9，r=0.999 9。

3-BP色譜圖(A)與3-BP-LCNP色譜圖(B)的保留時間一致，空白LCNP色譜圖(C)在此時間內無干擾峰出現，表明輔料對3-BP含量測定無干擾，專屬性良好(見圖1)。

低、中、高三種濃度的3-BP的日內精密度RSD分別為1.3%、3.0%、2.17%，日間精密度RSD分別為0.8%、1.63%、2.12%，均小于4%，符合測定要求。樣品24 h內3-BP峰面積RSD小于2%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。低、中、高三個濃度的3-BP平均回收率分別為96.15%、97.96%、92.86%，回收率均在90%以上，滿足試驗要求(見表2)。

2.2 包封率及載藥量方法學結果

2.2.1 透析時間考察 每小時取樣結果顯示，透析液中游離的3-BP含量為1.566、1.67、1.727、1.751、1.753、1.754、1.754 μg/mL，隨著透析時間的延長，游離藥物量有所增加，但透析5 h之后，透析液中含量基本不再增加，說明透析5 h后，達到平衡狀態(tài)，所以將透析時間定為5 h。

2.2.2 方法回收率 低、中、高三個濃度的3-BP平均回收率均大于80%，3-BP能自由透過透析膜，說明透析法可用于測定3-BP-LCNP的包封率(見表3)。

表2 3-BP回收率考察結果

表3 3-BP透析方法學方法回收率考察結果

2.2.3 加樣回收率 3-BP低、中、高三個濃度的平均回收率均大于90%，說明空白LCNP對透析法測定藥物的包封率影響較小(見表4)。

表4 3-BP透析方法學加樣回收率考察結果

2.3 處方篩選結果 在偏光顯微鏡下，層狀液晶因具有光學雙折射性，呈十字花紋或油狀花紋；立方液晶因其不具有光學雙折射性，在偏光顯微鏡下呈暗視野。結果所示，當含水量為20%時大部分未形成立方液晶，少部分形成層狀液晶；當含水量超過70%時都形成立方液晶，但是當含水量在40%～60%時，立方液晶呈現黏稠膠狀，不利于靜脈給藥，因此選擇在制備的過程中加入過量的水(見圖2、表5)。

表5 脂質立方液晶處方篩選

C:立方液晶；L:層狀液晶；N:未形成液晶

2.4 正交試驗優(yōu)化處方結果 正交試驗設計結果顯示(見表6)，影響因素由大到小的順序依次為Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ，不同因素內各水平對結果的影響強弱為：Ⅰ1>Ⅰ3>Ⅰ2,Ⅱ1>Ⅱ3>Ⅱ2,Ⅲ2>Ⅲ3>Ⅲ1,Ⅳ3>Ⅳ1>Ⅳ2。根據正交試驗方差分析結果，GMO/F127比例、分散相的用量、攪拌時間對處方包封率均有顯著影響，通過正交試驗獲得的最佳處方為Ⅰ1Ⅱ1Ⅲ2Ⅳ3，即處方為：3-BP 26.67 mg，GMO 0.889 g，F127 0.111 g，預熱的純水25 mL，即得到包封率為72.53%的制劑處方(見表7)。

表6 3-BP-LCNP處方優(yōu)化正交設計L9(34)結果

表7 L9(34)正交試驗方差分析結果

F0.05(2,2)=19.00

2.5 3-BP-LCNP制備工藝優(yōu)化

2.5.1 均質壓力 結果顯示，當均質壓力逐漸增高時，3-BP-LCNP的包封率和粒徑逐漸降低。由表8可知，3-BP-LCNP分散度與均質壓力關聯較小，考慮到過高的均質壓力可能破壞立方液晶的結構，本試驗選擇14 900 psi作為最終的均質壓力(見圖3)。

表8 均質壓力考察

2.5.2 均質次數 結果顯示，3-BP的包封率與均質次數關聯較小，但是對3-BP的平均粒徑影響較大，當逐漸增加均質次數時，立方液晶納米粒的粒徑逐漸下降。當均質次數超過6次時，粒徑下降的幅度較小；當均質次數超過9次時，粒徑分布集中。因此最終選擇循環(huán)次數為9次作為最優(yōu)制備工藝條件(見圖4、表9)。

2.6 3-BP-LCNP的制備 稱取GMO 0.889 g，F127 0.111 g置于燒杯內，60 ℃恒溫水浴，磁力攪拌至完全融化后加入3-BP 26.67 mg，緩慢加入提前預熱的純水25 mL至油相中作為前體溶液，然后將前體溶液在14 900 psi，9次循環(huán)下通過高壓均質，即得乳白色3-BP-LCNP。

表9 均質次數考察

3 討論

立方液晶是自發(fā)形成的熱力學穩(wěn)定的體系，可以結合多種性質的藥物，并且可以高效地將藥物遞送至靶部位，廣泛應用于抗腫瘤藥物、糖尿病藥物、眼部藥物的遞送和藥妝行業(yè)，具有較高的商業(yè)前景。立方液晶作為一種新型藥物載體，具有多種制備途徑和給藥方式，如透皮給藥、注射給藥、口服給藥等，相信隨著高壓均質和高壓滅菌技術的完善，立方液晶將具有更廣闊的應用前景。

本實驗初步篩選了輔料甘油單油酸酯(GMO)、穩(wěn)定劑(泊洛沙姆407)、分散相(純水)用量、藥物用量和攪拌時間對脂質立方液晶晶型的影響，選擇能夠形成立方液晶晶型的處方，并采用正交設計以包封率為指標優(yōu)化制劑處方工藝，選擇最高的包封率的制劑處方。通過單因素實驗，以粒徑和包封率為指標，考察最佳的制備工藝。由于注入法制備得到的立方液晶粒徑較大，且不穩(wěn)定、不均一，而通過一定的外界能量如均質、超聲、高速攪拌等制備的納米粒，不僅能夠增加納米粒在水中的分散程度，還可以提高藥物包封率，因此本實驗考慮藥物性質最終選擇注入法聯合高壓均質法制備3-BP-LCNP。

本實驗最終制備的立方液晶處方為：GMO用量為0.889 g，泊洛沙姆407用量為0.111 g，3-BP用量為26.67 mg，分散相用量為25 mL，攪拌20 min即得到3-BP-LCNP。在14 900 psi壓力下，均質9次得到的3-溴丙酮酸脂質立方液晶納米粒的粒徑穩(wěn)定在192.7 nm左右，包封率達到了70%以上，粒徑、包封率均符合要求。本實驗篩選的處方及制備工藝簡單可行，制得的立方液晶納米粒穩(wěn)定性好，為下一步體內外釋放評價奠定了基礎。