LncRNA-ROR抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用研究

胡世豐，雷 春，施 煒，查 誠(chéng)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著國(guó)人生活習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)[1-3]。目前，結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)為主，輔以化療、放療、免疫治療等綜合治療，盡管取得很好的效果，仍然有相當(dāng)一部分病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。臨床上亟需了解結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以期提高早期診斷率和病人的生存率[4-6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long chain noncoding RNA,Lnc RNA)是一類長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的非編碼RNA[7]。研究[8]表明，LncRNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)。在腫瘤發(fā)生中，LncRNA在多層面尤其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面影響細(xì)胞的正常功能，引起細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化異常[9]。LncRNA在癌基因的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，其表達(dá)的失控可引起腫瘤的增殖、侵襲、凋亡異常[10]。LOEWER等[11]在2010年報(bào)道了一種能調(diào)節(jié)已經(jīng)分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)換為多能誘導(dǎo)干細(xì)胞重編程過(guò)程的LncRNA，并將這該RNA命名為L(zhǎng)ncRNA-ROR(regulator of reprogramming，ROR),以下簡(jiǎn)稱為ROR。ROR不僅能調(diào)控細(xì)胞的重編程過(guò)程，其在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡中發(fā)揮重要作用并與病人預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。但是LncRNA-ROR在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用尚欠充分研究。在前期發(fā)表的研究中，我們發(fā)現(xiàn)ROR在癌組織中的表達(dá)相比于癌旁組織有明顯降低，臨床病理資料顯示ROR的表達(dá)與病人的TNM分期有關(guān)，qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)SW620中的ROR表達(dá)增加，其高表達(dá)導(dǎo)致SW620增殖能力的下降。為了進(jìn)一步了解ROR在結(jié)直腸癌中的作用，我們采用侵襲、遷移、劃痕實(shí)驗(yàn)研究ROR在結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移中的作用?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染、計(jì)數(shù) 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620用含10%FBS的1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將合成的含ROR的慢病毒滴入培養(yǎng)液中，24 h后換液，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞SW620/Vector、SW620/ROR用含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。用無(wú)血清培養(yǎng)液把細(xì)胞懸浮并稀釋至10 mL左右，取1 mL 的細(xì)胞懸液加入1 mL 的0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液?；靹蚝蟮稳胙蛴?jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)。

1.2 遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液后無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓處理8 h。用胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)整成1×105/mL，在小室的下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)液，上室加入200 μL細(xì)胞懸液。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用鑷子取出小室，吸去上室中培養(yǎng)液，用棉棒擦拭小室的上室內(nèi)面后將上室放入用甲醇配置的0.1%結(jié)晶紫染液固定、染色30 min。PBS液漂洗兩次后在倒置顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。

1.3 侵襲實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓處理8 h。Matrigel膠放到4 ℃冰箱中過(guò)夜，在冰上將無(wú)血清培養(yǎng)液與Matrigel膠按5∶1比例混合，取24孔板，每孔加入50 μL稀釋后的Matrigel膠，37 ℃培養(yǎng)箱重放置30 min。將細(xì)胞濃度調(diào)整成1×105/mL，在小室的下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)液，上室加入200 μL細(xì)胞懸液。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用鑷子取出小室，擦拭小室的上室內(nèi)面后將上室放入用甲醇配置的0.1%結(jié)晶紫染液固定、染色30 min。PBS液漂洗后在倒置顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞，PBS緩沖液漂洗兩次后，胰酶消化，吸去胰酶后用含10%血清的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞按5×105/孔接種于6孔板中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。次日將細(xì)胞換液，20 μL的黃槍頭及尺子進(jìn)行高于蒸汽滅菌處理。待細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用黃槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次洗去劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液。拍照后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，去除漂起來(lái)的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ROR導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力降低 SW620細(xì)胞在ROR過(guò)表達(dá)后，穿過(guò)人工膜的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)ROR 后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力減弱(P<0.01)(見(jiàn)表1、圖1)。

表1 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力比較

2.2 ROR抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的劃痕愈合 在同樣的初始劃痕距離下，經(jīng)過(guò)48 h的培養(yǎng)后，相比于空載體對(duì)照組，ROR過(guò)表達(dá)SW620細(xì)胞間間距較大(P<0.01)(見(jiàn)表2、圖2)。

分組n0h細(xì)胞間距48h細(xì)胞間距SW620-Vector330.03±1.224.20±1.07SW620-ROR329.23±1.569.67±1.72t—0.974.68P—>0.05<0.01

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)證明人類基因組有約98%為非編碼基因，LncRNA占其中的80%[14]。LncRNA期初被當(dāng)作轉(zhuǎn)錄噪聲而未被重視，但越來(lái)越多的研究表明LncRNA在多個(gè)腫瘤中發(fā)揮重要作用。SUN等[15]發(fā)現(xiàn)MEG3調(diào)控胃癌的增殖和凋亡，在胃癌中提示預(yù)后不良的指標(biāo)。LIU等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA-LET在肺癌中通過(guò)抑制EMT和Wnt/β-catenin抑制肺癌的進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌中，SNHG1表達(dá)增高，在非小細(xì)胞肺癌中干擾SNHG1表達(dá)后細(xì)胞增殖受抑制[17]。ROR是新近發(fā)現(xiàn)的參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展多個(gè)過(guò)程的LncRNA。FAN等[18]研究發(fā)現(xiàn)ROR通過(guò)阻礙組蛋白G9A甲基轉(zhuǎn)移酶、促進(jìn)組蛋白H3K9甲基化的釋放，從而激活TESC啟動(dòng)子。沉默ROR后，通過(guò)G9A甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的H3K9甲基化引起的TESC啟動(dòng)子的表達(dá)被抑制，進(jìn)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究表明，在不沉默ROR的情況下，沉默TESC啟動(dòng)子引起腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移方面類似的現(xiàn)象。從而證實(shí)，ROR作為一個(gè)誘餌RNA通過(guò)抑制組蛋白修飾酶的結(jié)合促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ZHAN等[19]研究表明ROR通過(guò)調(diào)控ZEB1來(lái)促進(jìn)胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。LI等[20]ROR與鼻咽癌的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥均有關(guān)。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中ROR的表達(dá)明顯低于周圍正常組織，其表達(dá)與病人的TNM分期有關(guān)，但關(guān)于ROR在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用尚缺乏深入的研究。

細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)是模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的理想體外模型，遷移實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell小室將腫瘤細(xì)胞隔離在無(wú)血清培養(yǎng)液中，腫瘤細(xì)胞為了獲取有血清的培養(yǎng)液，必須爬行穿過(guò)小室的孔隙，我們通過(guò)技術(shù)穿過(guò)孔隙的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)除了常規(guī)的遷移實(shí)驗(yàn)外，我們?cè)赥ranswell的上室中加入了Matregel膠，腫瘤細(xì)胞為了到達(dá)有血清的下室，除了穿過(guò)小室的孔隙，還需要穿過(guò)Matregel膠，結(jié)合遷移實(shí)驗(yàn)，可以更加完整的模擬腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移途徑。我們的研究發(fā)現(xiàn)ROR過(guò)表達(dá)的SW620細(xì)胞不論在遷移還是在侵襲實(shí)驗(yàn)中，均表現(xiàn)出較低的遷移、侵襲能力。細(xì)胞劃痕是模擬細(xì)胞爬行愈合能力的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)貼壁細(xì)胞劃痕后觀察細(xì)胞爬行愈合能力來(lái)評(píng)估細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。我們?cè)趧澓蹖?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ROR過(guò)表達(dá)的SW620細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞在初始劃痕時(shí)間距無(wú)明顯差異，經(jīng)過(guò)48 h的培養(yǎng)液后，SW620/ROR組細(xì)胞的間距明顯寬于對(duì)照組，說(shuō)明ROR的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致SW620細(xì)胞的爬行愈合能力下降。綜上所述，SW620細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ROR導(dǎo)致SW620細(xì)胞的遷移、侵襲、劃痕愈合能力下降，表明ROR的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致結(jié)直腸SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力下降，ROR作為潛在的抑癌基因，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。