鴉膽子苦素D通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的能量代謝研究

王 雨，羅 璨，吉兆寧

乳腺癌的發(fā)病率很高，被認(rèn)為是女性最常見的癌癥之一[1]。其中，三陰性乳腺癌(TNBC)易于復(fù)發(fā)且死亡率高，被認(rèn)為是最嚴(yán)重的乳腺癌亞型[2]。包括外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法在內(nèi)的多種療法已被用于治療乳腺癌。然而，乳腺癌仍然是臨床治療中最具挑戰(zhàn)性的腫瘤之一?；瘜W(xué)療法是乳腺癌術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但化療藥物通常會(huì)引起不良作用和耐藥性。開發(fā)有效的天然抗腫瘤藥物對(duì)于克服耐藥性至關(guān)重要。鴉膽子的種子被用作傳統(tǒng)中藥，常用于治療瘧疾、痢疾和癌癥[3]。鴉膽子苦素D是從鴉膽子的果實(shí)中提取的一種類胡蘿卜素[4]。早期研究[5]表明，鴉膽子苦素D對(duì)胰腺癌、慢性粒細(xì)胞性白血病、肝細(xì)胞癌和骨肉瘤等具有抑制作用。能量代謝重組(EMR)是癌癥的最關(guān)鍵標(biāo)志之一[6]。最近的研究[7]表明，EMR可能是乳腺癌靶向治療的潛在方向。目前尚無(wú)關(guān)于鴉膽子苦素D對(duì)腫瘤細(xì)胞能量代謝影響的研究。本研究探討鴉膽子苦素D在TNBC MDA-MB-231細(xì)胞能量代謝中的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自江蘇凱基生物科技有限公司(中國(guó))。鴉膽子苦素D樣品(純度> 98%)(暨南大學(xué)中醫(yī)藥與天然產(chǎn)物研究所，中國(guó))，二甲基亞砜(DMSO)(久億化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Amresco，美國(guó))，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco，美國(guó))，青霉素/鏈霉素溶液、順鉑、BCA蛋白定量試劑盒、β-actin抗體和抗兔免疫球蛋白(凱基生物科技有限公司，中國(guó))，葡萄糖試劑盒、乳酸試劑盒、ATP試劑盒、己糖激酶(HK)試劑盒、磷酸果糖激酶(PFK)試劑盒、丙酮酸激酶(PK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(建成生物科技有限公司，中國(guó))，PI3K抗體(Affinity，美國(guó))，Akt和p-Akt抗體(武漢三鷹生物有限公司，中國(guó))。CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國(guó))，超聲裂解儀(新芝生物科技股份有限公司，中國(guó))，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，生物倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中。置于在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。每隔3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 鴉膽子苦素D配制 將鴉膽子苦素D溶解在DMSO中，并儲(chǔ)存在-20 ℃。使用前，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 將MDA-MB-231細(xì)胞接種到96孔板(5×103/孔)中并培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的順鉑(1.56～25.00 μmol/L)和鴉膽子苦素D(1.56～25.00 μmol/L)培養(yǎng)24 h，設(shè)立不加藥物的對(duì)照組。隨后，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后，棄培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO。最后，測(cè)量各組在490 nm處的吸光度(OD)值以評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 ATP濃度的測(cè)定 將細(xì)胞以1×105/mL的密度接種，并在37 ℃用不同濃度的鴉膽子苦素D(1、2、4 μmol/L)或0.1%DMSO(對(duì)照組)處理24 h。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，并收集細(xì)胞沉淀。然后將細(xì)胞沉淀物用PBS洗滌，并用超聲儀裂解5 min。將細(xì)胞裂解液在4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取上清液儲(chǔ)存在-80 ℃。使用ATP試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中的ATP含量，使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量。

1.6 葡萄糖消耗量和乳酸生成量測(cè)定 細(xì)胞以1×105/mL的密度接種。在37 ℃下用不同濃度的鴉膽子苦素D(1、2和4 μmol/L)或0.1%DMSO(對(duì)照組)處理24 h后收集培養(yǎng)基，并在-80 ℃保存。使用葡萄糖和乳酸試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸的濃度。葡萄糖消耗量和乳酸生成量為24 h培養(yǎng)期開始和結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基含量的改變量。

1.7 糖酵解關(guān)鍵酶活性測(cè)定 將細(xì)胞以1×105/mL的密度接種，并在37 ℃用不同濃度的鴉膽子苦素D(1、2、4 μmol/L)或0.1%DMSO(對(duì)照組)處理24 h。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，然后收集細(xì)胞沉淀。然后將細(xì)胞沉淀用PBS洗滌，并用超聲儀裂解5 min。將細(xì)胞裂解液在4 ℃ 以12 000 r/min離心15 min，收集上清液，并儲(chǔ)存在-80 ℃。使用HK、PFK、PK和LDH試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中的HK、PFK、PK和LDH活性，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度。

1.8 Western blotting分析蛋白表達(dá) 使用總蛋白提取試劑盒提取MDA-MB-231細(xì)胞的總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒分析樣品的總蛋白濃度。各組蛋白樣品通過10%SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后用TBST洗滌3次。隨后，將膜與PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶5 000)、p-Akt(1∶5 000)和β-actin(1∶400)抗體在4 ℃孵育過夜。然后將膜與抗兔IgG(1∶2 000)孵育1 h，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法染色，使用G:BOX chemiXR5成像，并使用Gel-Pro32軟件進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度鴉膽子苦素D抑制MDA-MB-231細(xì)胞活力的比較 鴉膽子苦素D處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h的IC50值為(44.25±1.65)μmol/L。MTT結(jié)果表明，在1.56～25.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)，鴉膽子苦素D均可濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性(P<0.01)(見表1)。

表1 各組細(xì)胞活力的比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05；與3.13 μmol/L組比較#P<0.05；與6.25 μmol/L組比較△P<0.05；與12.50 μmol/L組比較□P<0.05

2.2 鴉膽子苦素D對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中ATP含量的影響 與對(duì)照組相比，1、2、4 μmol/L鴉膽子苦素D均可降低MDA-MB-231細(xì)胞中ATP含量(P<0.05)(見表2)。

表2 各組細(xì)胞中ATP含量的比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

2.3 不同濃度鴉膽子苦素D抑制MDA-MB-231細(xì)胞有氧糖酵解作用的比較 與對(duì)照組相比，1、2、4 μmol/L鴉膽子苦素D處理MDA-MB-231細(xì)胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量均減少(P<0.05)(見表3)。

表3 各組細(xì)胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

2.4 鴉膽子苦素D對(duì)糖酵解關(guān)鍵酶活性的抑制作用 與對(duì)照組相比，1、2、4 μmol/L鴉膽子苦素D均可降低MDA-MB-231細(xì)胞中HK、PFK、PK和LDH的活性(P<0.05)(見表4)。

2.5 鴉膽子苦素D對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的抑制作用 與對(duì)照組相比，2、4 μmol/L鴉膽子苦素D處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，均可抑制細(xì)胞中PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)(P<0.05)(見圖1、表5)。

表4 各組細(xì)胞中HK、PFK、PK、LDH活性比較

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

3 討論

盡管多種治療方法被應(yīng)用于TNBC，但是TNBC依然缺乏特定的靶向治療，預(yù)后較差。之前的研究[7]表明，乳腺癌的能量代謝過程可能作為潛在的靶向治療目標(biāo)。本研究初步探討了鴉膽子苦素D對(duì)于TNBC細(xì)胞能量代謝的影響，并證實(shí)鴉膽子苦素D能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的有氧糖酵解過程。

Warburg效應(yīng)指出，腫瘤細(xì)胞傾向于利用有氧糖酵解來(lái)產(chǎn)生能量，而不是通過氧化磷酸化作用。這種現(xiàn)象存在于包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥細(xì)胞內(nèi)[8]。有氧糖酵解過程中1分子葡萄糖分解產(chǎn)生2分子ATP，而腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖需要ATP[9]。本研究結(jié)果表明，在鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中ATP含量減少，可能出現(xiàn)供能不足。

有氧糖酵解是葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，最終生成乳酸的過程[10]。葡萄糖作為有氧糖酵解底物，可以為機(jī)體提供能量，是細(xì)胞主要能量來(lái)源。乳酸是有氧糖酵解最終產(chǎn)物，同時(shí)在能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。用鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量都明顯減少，提示MDA-MB-231細(xì)胞中有氧糖酵解過程被鴉膽子苦素D抑制。

分組nPI3KAktp-Akt對(duì)照組30.19±0.020.23±0.030.21±0.021μmol/L鴉膽子苦素D30.16±0.01?0.20±0.020.16±0.012μmol/L鴉膽子苦素D30.09±0.02?#0.20±0.010.07±0.02?#4μmol/L鴉膽子苦素D30.04±0.01?#△0.19±0.020.02±0.01?#△F—76.412.91132.12P—<0.01>0.05<0.01MS組內(nèi)—0.0000.0000.000

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05；與1 μmol/L鴉膽子苦素D組比較#P<0.05；與2 μmol/L鴉膽子苦素D組比較△P<0.05

有氧糖酵解過程通過HK、PFK、PK、LDH 4種關(guān)鍵酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，它們?cè)谡{(diào)節(jié)過程中發(fā)揮不同的作用[11]。糖酵解的第一步是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，HK在其中起關(guān)鍵作用[12]。PFK催化糖酵解的另一個(gè)限速步驟，即6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?,6-二磷酸果糖[13]。PK催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，并在此過程中生成ATP[14]。LDH催化糖酵解途徑中的最后一步，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。在用鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中的HK、PFK、PK、LDH活性均明顯降低。

PI3K/Akt信號(hào)途徑參與多種生物學(xué)過程，包括葡萄糖代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和血管生成，在腫瘤的生長(zhǎng)和增殖中起著重要的作用[15]。Akt被認(rèn)為是Warburg激酶，被激活后發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)閜-Akt，通過刺激HK和PFK促進(jìn)葡萄糖代謝。PI3K是一種脂質(zhì)激酶，可以增強(qiáng)HK和PFK活性從而增加糖酵解通量[16]。研究[17]表明，PI3K/Akt信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)PK和LDH活性。本研究結(jié)果表明用鴉膽子苦素D處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中的PI3K、p-Akt表達(dá)均降低，提示MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性被鴉膽子苦素D所抑制。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示鴉膽子苦素D可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而降低有氧糖酵解關(guān)鍵酶活性并抑制有氧糖酵解，減少M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞能量供應(yīng)。

綜上所述，鴉膽子苦素D通過抑制MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路,從而降低有氧糖酵解水平，減少細(xì)胞能量供應(yīng)。本研究結(jié)果提示鴉膽子苦素D可能作為治療TNBC的潛在抗腫瘤藥物，為未來(lái)藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。