蝦青素介導Nrf2信號通路對大強度運動誘導大鼠腎臟損傷的保護作用

李鋒 曹卉 曹建民

摘 要：目的：觀察補充蝦青素能否介導核因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路，緩解長時程、大強度運動誘導的氧化應激，降低腎臟細胞凋亡水平，保護大鼠腎臟結構/功能的正常。方法：7周齡SD雄性大鼠，適應性飼養(yǎng)及訓練后隨機分為對照組（C組，10只），大強度訓練組（HT組，15只），蝦青素+大強度訓練組（HTA組，15只）。C組無運動干預，HT和HTA組進行6周遞增負荷跑臺訓練。訓練期間HTA組以蝦青素溶液灌胃，每天1次，劑量為20 mg/kg/d，其他組灌胃等體積大豆油。末次訓練結束后24 h取材，測定血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平，測定腎臟凋亡指數(shù)、B細胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、Nrf2、p-Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白表達及腎臟組織總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）濃度。結果：與C組相比，HT組大鼠腎臟組織形態(tài)發(fā)生病理改變，血清Cr和BUN水平升高（P<0.01），腎臟細胞凋亡水平及腎臟Bax蛋白表達增強（P<0.01），Bcl-2蛋白表達減少（P<0.01），Nrf2蛋白表達變化無統(tǒng)計學差異（P>0.05），但p-Nrf2、HO-1蛋白表

關鍵詞：蝦青素;大強度運動;氧化應激;核因子E2相關因子2（Nrf2）;大鼠

Abstract：Objective： To observe whether supplementation of astaxanthin can mediate Nrf2 pathway and alleviate renal injury in rats after 6-week high-intensity exercise. Methods： 7-week SD male rats were divided into 3 groups randomly： control group （C group， n=10）， high intensity training group （HT group， n=15）， astaxanthin and high intensity training group （HTA group， n=15） after adaptive feeding and exercise. There was no exercise intervention in C group， the HT and HTA group underwent 6-week incremental load treadmill exercise. During the training period， the rats in HTA group were administered astaxanthin 20 mg/kg intragastrically daily， the other groups were administered equal amount of soybean oil. The serum creatinine （Cr） and blood urea nitrogen （BUN）， myocardial apoptosis index， the expression of myocardial B cell lymphoma-2 protein （Bcl-2）， Bcl-2 associated x protein （Bax）， nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， myocardial malonaldehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）and total antioxidative capacity （T-AOC） activity were detected at 24 hours after the last training. Results： Compared with C group， histopathological changes in kidney were observed in HT group， serum Cr and BUN levels increased （P<0.01）， renal apoptosis and Bax expression in the kidney were enhanced （P<0.01）， Bcl-2 expression decreased（P<0.01）， there was no statistical difference in Nrf2 （P>0.05）， but p-Nrf2 and HO-1 expression decreased （P<0.01 orP<0.05）， SOD and T-AOC activity decreased （P<0.01）， MDA concentration increased （P<0.01）. Compared with the HT group， histopathological changes in kidney were significantly relieved in HTA group， serum Cr and BUN levels increased （P<0.01）， renal apoptosis and Bax expression in the kidney decreased （P<0.01）， Bcl-2， Nrf2， p-Nrf2 and HO-1 expression increased （P<0.05 orP<0.01）， SOD and T-AOC activity increased （P<0.05 orP<0.01）， MDA concentration decreased （P<0.05）. Conclusion： These results demonstrate that supplementation of astaxanthin can mediate Nrf2 pathway， up-regulate the protein expression of Nrf2 and HO-1， increase the activity of SOD and T-AOC， and reduce the degree of oxidative stress and apoptosis of rat kidney cells induced by 6-week high-intensity exercise training， and alleviate the occurrence of renal injury effectively.

Key words：astaxanthin; high-intensity exercise; oxidative stress; nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）; rat

蝦青素是一種萜烯類不飽和化合物，天然存在于多種海洋生物和微生物中。蝦青素中由羥基和酮基構成的共軛雙鍵，能夠通過提供電子，將自由基轉化為更為穩(wěn)定的產物，終止自由基鏈式反應，是一種功能強大的抗氧化劑[1]?，F(xiàn)有研究已證實，蝦青素具有對抗氧化應激和炎癥的作用，可以有效地預防心血管疾病，抗癌，調節(jié)免疫系統(tǒng)[1]。長時程、大強度運動中腎臟血流急劇下降，運動后血液的大量回流，伴隨著缺血再灌注過程，氧化應激水平也隨之增強，極易引發(fā)腎臟損傷[2]。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的內源性抗氧化應激通路。正常生理狀態(tài)下，Nrf2處于非活化狀態(tài)，位于細胞質內與kelch樣ECH相關蛋白1（kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）結合;氧化應激狀態(tài)下，Nrf2活化后與keap1解離進入細胞核與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）相互作用，調控下游血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶的轉錄和表達，從而實現(xiàn)對抗氧化應激損傷的保護作用[3]。有研究表明，蝦青素可以促進Nrf2的核轉位和轉錄活性，并上調SOD、HO-1的表達，淬滅較高水平的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），最終抑制腎小球系膜細胞中高糖誘導的腎纖維化[4]。同時，蝦青素預處理通過改善B淋巴細胞瘤因子-2（B cell lymphoma-2 protein，Bcl-2）蛋白家族表達，可以顯著減輕脂肪肝缺血再灌注損傷中的損傷程度[5]。目前，蝦青素對運動性腎臟損傷的保護作用的相關研究較少。本研究通過在6周大強度訓練期間對大鼠進行蝦青素補充，探討蝦青素能否通過介導Nrf2通路，延緩大強度運動訓練誘導的氧化應激，有效抑制大鼠腎臟細胞的過度凋亡，進而保護腎臟結構/功能的正常，為蝦青素在長時程、大強度運動訓練致運動性腎損傷防控中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象和分組

SPF級雄性SD大鼠，體重202.41±9.52 g，7周齡，購自中華人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心（動物生產合格證編號SCXK（軍）2012-0004）。北京體育大學SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對濕度55%～75%，正常晝夜節(jié)律。

大鼠在進行4 d適應性喂養(yǎng)后，以10 m/min，坡度0 °，10 min/d的運動量進行適應性訓練，篩選以剔除不能完成訓練及運動能力較差的大鼠，按照數(shù)字隨機分組法將40只大鼠隨機分為3組：安靜對照組（C組，10只），大強度訓練組（HT組，15只）和蝦青素+大強度訓練組（HTA組，15只）。HT組、HTA組大鼠因訓練強度及疲勞恢復等原因出現(xiàn)死亡情況，最終HT組剩余12只，HTA組剩余13只。

1.2 訓練和營養(yǎng)補充方案

C組正常飼養(yǎng)，不進行運動干預;HT和HTA組進行6周遞增負荷跑臺訓練，訓練方案（見表1）。第2周訓練開始，每次從10 m/min開始，每5 min速度增加5 m/min，直至本周目標速度。最后一周大鼠若無法維持目標速度，則運動至力竭。

訓練期間，HTA組每天訓練后進行1次蝦青素（純度>95%，購自Santa Cruz Biotechnology公司）灌胃，使用食用大豆油（購自益海嘉里食品營銷有限公司）作為溶劑，配置濃度為4 mg/ml的蝦青素溶液，通過預實驗及文獻[6-7]確定灌胃劑量為20 mg/kg/d，灌胃體積為5 ml/kg，C組和HT組灌胃等體積食用大豆油。

1.3 樣本采集

末次訓練結束后24 h處死大鼠。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，腹總動脈取血5 ml并放入促凝管中，靜置2 h待血清和血細胞分離后，將其放入4 ℃的低溫離心機進行3 000 rpm離心15 min，取上層血清分裝后置-20 ℃冰箱中保存待查。

取左側腎臟置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，準確稱取重量，按照組織重量/勻漿介質1 ∶ 9的比例加入PBS緩沖液，充分研磨制成10%的腎臟組織勻漿液，5 000 rpm離心5 min取上清待測。另取右側腎臟浸入4%多聚甲醛中固定。

1.4 指標測試

1.4.1 腎臟組織病理學評價

將腎臟從多聚甲醛固定液中取出，流水洗滌12 h后進行梯度酒精脫水、透明，石蠟包埋制成4 μm切片，HE染色后在400倍光鏡下，觀察腎臟組織病理學變化。

1.4.2 腎臟細胞凋亡指數(shù)

采用TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡指數(shù)。將腎臟從固定液中取出，流水洗滌12 h，梯度酒精脫水后透明，石蠟包埋，制成石蠟切片。將組織切片上機在掃描儀的鏡頭下逐步移動，邊移動邊成像進而將組織切片上所有的組織信息都掃描成像。用Pannoramic Viewer軟件進行400倍放大后截取任意部位圖片，掃描完成后進入Quant Center分析軟件自動識別，切片上細胞核呈深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍色為陰性。通過對每個組織點進行識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性、陰性的面積（單位：像素）及陽性百分比，隨后進行細胞凋亡指數(shù)（H-score）評分，從而對其進行半定量分析。H-score=（弱陽性細胞密度×1）+（中陽性細胞密度×2）+（強陽性細胞密度×3）[8-9]。TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司。

1.4.3 蛋白質免疫組化測試

采用免疫組化法檢測腎臟Nrf2、Nrf2磷酸化（pS40）、HO-1、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）和Bcl-2的蛋白表達水平。將制好的石蠟切片脫蠟水化后進行抗原修復，避光、室溫孵育25 min，脫色洗滌3次后進行血清封閉，封閉后加入一抗、二抗進行DAB顯色，顯色終止隨后脫水封片。于顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡視野（×400），每個視野隨機計數(shù)100個細胞，計算其中陽性細胞數(shù)得到平均值，按照著色深淺對蛋白表達情況進行分級：無著色為陰性，黃色為弱陽性，棕色為中陽性，棕褐色為強陽性。按照著色強度和著色范圍用H-socre方法進行半定量分析，H-score計算方法同1.4.2。Nrf2、Nrf2磷酸化（pS40）、HO-1、Bax和Bcl-2的一抗、相應二抗和DAB顯色劑，購自Sigma及Servicebio公司。

1.4.4 其他指標的測試

采用Jaffe苦味酸法測定血清肌酐（creatinine，Cr），采用二乙酰-肟法測定血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），試劑盒購自北京華英生物技術研究所。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定腎臟總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、SOD活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度，酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國BD公司。以上指標的測試過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結果用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間分析采用單因素方差分析，P<0.05表示為顯著性差異，P<0.01表示為非常顯著性差異。

2 結果

2.1 蝦青素和運動干預后大鼠腎臟組織病理學變化

光鏡下觀察顯示（圖1），C組大鼠腎臟組織形態(tài)正常，腎小球未出現(xiàn)淤血、變性和水腫現(xiàn)象，腎小管管腔內未發(fā)現(xiàn)管型;HT組大鼠腎臟組織形態(tài)較C組發(fā)生顯著改變，腎小球可見淤血，腎小管嚴重損傷，上皮細胞可見水腫、空泡變性和管腔擴張現(xiàn)象，管腔中有多種管型出現(xiàn);HTA組大鼠腎臟組織形態(tài)較HT組有所改善，但腎小管上皮細胞仍輕度水腫、空泡變性和管腔擴張出現(xiàn)，但管腔內無蛋白管型和細胞管型出現(xiàn)。

2.2 蝦青素和運動干預后大鼠血清Cr和BUN濃度變化

本研究的結果顯示（表2），與C組比較，HT組血清Cr和BUN水平均顯著升高（P<0.01）;與HT組比較，HTA組血清Cr和BUN水平均顯著性降低（P<001）。從結果可以看出，本研究采用的6周遞增負荷跑臺訓練誘發(fā)了大鼠腎臟功能損傷，而訓練期間的蝦青素干預有效地緩解了大鼠腎臟功能損傷。

2.3 蝦青素和運動干預后大鼠腎臟Nrf2、p-Nrf2和HO-1蛋白表達變化

本研究的結果顯示（表3、圖2），與C組比較，HT組腎臟Nrf2表達無明顯差異（P>0.05），但p-Nrf2和HO-1表達均呈現(xiàn)顯著下降（P<0.01或P<0.05）;與HT組比較，HTA組的Nrf2、p-Nrf2和HO-1表達均顯著上調（P<0.01或P<0.05）。

2.4 蝦青素和運動干預后大鼠腎臟SOD、T-AOC活性和MDA濃度變化

本研究的結果顯示（表4），與C組比較，HT組的SOD、T-AOC的活性均顯著降低（P<0.01），同時MDA的濃度顯著升高（P<0.01）。與HT組比較，HTA組的SOD、T-AOC的活性均較HT組顯著升高（P <0.01），同時MDA的濃度顯著下降（P<0.05），但與C組相比仍存在顯著差異（P<0.01）。由此說明，本研究的大強度訓練誘發(fā)了氧化應激反應，ROS產生增多，導致腎臟抗氧化狀態(tài)失衡，訓練期間蝦青素的干預通過激活Nrf2通路促進了抗氧化酶活性增強，進而改善了腎臟的氧化應激水平。

2.5 蝦青素和運動干預后大鼠腎臟細胞凋亡水平變化

TUNEL染色結果顯示（表5、圖3），與C組比較，HT組和HTA組腎臟細胞凋亡H-score顯著性升高（P<0.01）;與HT組比較，HTA組腎臟細胞凋亡H-score顯著性降低（P<0.01）。這表明大強度訓練誘發(fā)了腎臟細胞的過度凋亡，而訓練期間的蝦青素干預在一定程度上抑制了腎臟細胞的過度凋亡，但與正常水平仍存在顯著性差異。

2.6 蝦青素和運動干預后大鼠腎臟Bax和Bcl-2蛋白表達變化

從凋亡相關蛋白表達變化可知（表6、圖4），促凋亡蛋白Bax表達，HT組較C組顯著升高（P<0.01）;HTA組較HT組顯著性下降（P<0.01），但較C組仍顯著升高（P<0.01）。抑制凋亡蛋白Bcl-2表達，HT組較C組顯著下降（P<0.01），HTA組較HT組顯著升高（P<0.05），且與C組無統(tǒng)計學差異（p>0.05）。通過分析Bcl-2/Bax比值后發(fā)現(xiàn)，HT組較C組顯著下降（P<0.01），而HTA組較HT組顯著升高（P<0.01），但仍低于C組（P<0.01）。

3 分析與討論

腎臟作為高灌注器官，對缺血缺氧極其敏感，長時程、大強度運動引發(fā)的缺血再灌注過程，超越了腎臟的自我調節(jié)能力，加劇了腎組織損傷程度。Cr是肌酸代謝的產物，釋放到血液中，最終隨尿液排出，其濃度變化主要由腎小球的濾過能力決定，血清Cr濃度升高意味著腎實質受損。尿素是蛋白質代謝的主要終產物，主要通過腎臟排泄，當腎實質發(fā)生損傷時，腎小球濾過率降低，血清BUN水平升高。因此常將血清Cr和BUN作為明確腎臟損傷程度的指標[10]。研究表明[11-12]，長時程、大強度運動可導致大鼠出現(xiàn)運動性腎臟損傷，表現(xiàn)為血清Cr和BUN水平升高。其主要誘因為：長時程、大強度運動刺激腎臟增加對水和鈉的重吸收，使腎臟對能量和氧氣的需求增加，而此時腎臟中血液灌注減少，極易引發(fā)缺血缺氧反應，造成腎臟結構/功能損傷[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)HT組血清Cr和BUN水平較C組顯著升高，同時結合大鼠腎臟組織形態(tài)的比較，說明6周遞增負荷跑臺訓練對大鼠腎臟結構/功能造成損傷。

Nrf2是抑制氧化應激和維持細胞內氧化還原平衡的關鍵轉錄因子，Nrf2的靶基因包含HO-1及SOD等大量抗氧化酶，參與解毒、修復、去除受損蛋白、抑制炎癥等過程[15-16]。非運動狀態(tài)下，胞漿中的Nrf2可與其負調節(jié)因子Keap1形成二聚體抑制Nrf2表達水平[17]。運動狀態(tài)下，產生大量的ROS，使Keap1結構發(fā)生變化，加速解偶聯(lián)作用，進而刺激Nrf2從胞漿轉移至胞核，導致核內的Nrf2蛋白表達升高，通過Nrf2/ARE信號通路，廣泛激活下游抗氧化應答過程，發(fā)揮清除自由基的作用，增強細胞存活[18]。但運動對Nrf2表達的調節(jié)作用，存在一定劑量效應。有文獻報道[19]，適宜的運動可以通過提高Nrf2水平，改善氧化應激水平和腎臟功能。但在本研究中，盡管與C組相比，HT組腎臟細胞的Nrf2水平無明顯變化，但其磷酸化水平顯著降低，下游的HO-1的表達水平、SOD和T-AOC的活性均顯著降低，同時MDA濃度顯著升高。說明長時程、大強度運動可誘導機體氧化應激反應增強，自由基大量生成的同時無法及時清除，在一定程度上抑制了Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用并引發(fā)了機體氧化還原狀態(tài)失衡。過量的ROS是加劇細胞凋亡的重要信號，有研究表明腎缺血再灌注可通過促凋亡途徑引發(fā)腎損傷[20]。細胞凋亡是基因控制下自主地、有序地細胞死亡過程，是機體為了更好地適應生存環(huán)境而采取的調控措施。Bcl-2蛋白家族廣泛參與細胞凋亡過程[21]，已經發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可以分為兩類，一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-2;另一類具有促進凋亡作用，如Bax。Bcl-2/Bax相對比值的變化與細胞凋亡關系密切[22]。在本研究中，HT組腎臟細胞凋亡水平和促凋亡蛋白Bax表達水平均較C組顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著降低，說明6周遞增負荷跑臺訓練加劇了腎臟細胞的凋亡。由此可知，當Nrf2不能正常編碼抗氧化酶類蛋白時，HO-1蛋白表達量顯著下降，抗氧化酶SOD和T-AOC活性顯著降低，同時脂質過氧化產物MAD濃度顯著升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低，機體抗氧化能力受損加重腎臟細胞損傷程度，增強凋亡水平。

磷酸化修飾是調節(jié)Nrf2功能的重要途徑，當Nrf2蛋白上第40位絲氨酸發(fā)生磷酸化時，可導致其與Keap1解離[23-24]，使抗氧化元件ARE及其保護性蛋白的合成過程被激活，調節(jié)腎臟氧化應激過程[25]。本研究中，HTA組血清Cr和BUN水平較HT組顯著下降，腎臟Nrf2、p-Nrf2和HO-1的表達水平、SOD和T-AOC活性均較HT組顯著升高，MDA濃度下降。上述結果說明當腎臟遭受氧化攻擊時，蝦青素作為Nrf2的激動劑，可以通過提高Nrf2蛋白表達水平及磷酸化水平，有效改善大鼠腎臟氧化應激狀態(tài)。付凱等[26]的研究中，2周蝦青素補充可以顯著提高發(fā)生缺血再灌注損傷腎臟中的SOD活性，并降低MDA水平。潘雷[27]的研究認為，天然蝦青素可上調Nrf2/ARE信號通路中相關基因的mRNA和蛋白在細胞內表達，這可能是其發(fā)揮抗氧化應激保護作用的機制之一。Zhu等[28]的研究也發(fā)現(xiàn)，蝦青素通過促進Nrf2核轉位并增加其下游蛋白HO-1和SOD的表達，降低MDA生成，減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化程度。與此同時，本研究中Bax蛋白表達水平顯著下降，Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值均顯著升高，說明訓練期間的蝦青素干預有效抑制了大強度運動誘導的腎臟細胞的過度凋亡，進而減輕了腎實質損傷。蝦青素改善細胞凋亡情況的機制可能與其激活Nrf2信號傳導途徑，進而調節(jié)Bcl-2家族蛋白表達水平有關。在Niture等[29]的研究中，Nrf2可直接與Bcl-2的抗氧化反應元件結合，通過上調其表達，阻止細胞凋亡。Fan等[30]在體外和體內實驗中均發(fā)現(xiàn)，蝦青素預處理通過調節(jié)Bcl-2家族蛋白表達，可以阻斷同型半胱氨酸誘導的線粒體功能障礙和氧化損傷，減少同型半胱氨酸誘導的心臟毒性。Guo等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素通過減輕氧化應激和線粒體相關的細胞凋亡，可以減輕大鼠嚴重燒傷后早期急性腎損傷。本研究結果說明，蝦青素可以通過介導Nrf2信號通路，改善腎臟氧化應激狀態(tài)和細胞凋亡水平，對大強度運動誘導的大鼠腎臟損傷發(fā)揮保護作用，蝦青素與運動性腎臟損傷的關系還有待進一步研究。

4 小結

本研究證實，6周大強度運動訓練可加劇腎臟氧化應激反應及細胞凋亡，腎臟結構/功能出現(xiàn)損傷。訓練期間的蝦青素補充可通過介導Nrf2通路上調Nrf2/p-Nrf2和HO-1表達，提高下游II相解毒酶HO-1蛋白表達及抗氧化酶SOD和T-AOC活性，減少促凋亡蛋白Bax表達，增強抗凋亡蛋白Bcl-2表達，緩解腎臟細胞的過度凋亡，保護腎臟結構/功能的正常。

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