香合歡硬實(shí)破除及叢芽誘導(dǎo)

許倩 林緯 黎起秦 袁高慶 賴家業(yè)

摘 要：香合歡具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但由于種子硬實(shí)度較高，無法滿足推廣、利用的需求。本試驗(yàn)以香合歡成熟種子為材料，進(jìn)行硬實(shí)破除及叢芽誘導(dǎo)研究。試驗(yàn)方法為：采用熱水及98 %濃硫酸進(jìn)行硬實(shí)破除;將切除子葉及大部分下胚軸后2 cm長的芽，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行叢芽誘導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下：熱水處理最佳的硬實(shí)破除方式為85 ℃熱水浸種24 h，發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別為80.00 %和95.56 %;98 %濃硫酸處理較好的硬實(shí)破除方式為酸蝕10～30 min，發(fā)芽率和發(fā)芽勢均達(dá)到98.89 %～100.00 %;最佳叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.3 mg/L。結(jié)論：種皮是造成香合歡種子休眠，萌發(fā)率較低的主要原因，而胚本身不含有影響其萌動(dòng)的物質(zhì)。香合歡屬于較易于誘導(dǎo)叢芽的一種木本植物。

關(guān)鍵詞：香合歡 硬實(shí)破除 組織培養(yǎng) 叢芽誘導(dǎo)

Abstract：Albizia odoratissima （L.f.） Benth has good economic value. However， due to the higher hardness of seeds， it is unable to meet the demands of development and utilization. In this experiment， the mature seeds of Albizia odoratissima were broken open and buds were induced. Method： Seeds were broken open with hot water and 98 % concentrated sulfuric acid.? Cluster buds were induced from cotyledon and 2 cm long buds of hypocotyl on the medium. Results：The optimum conditions of hot water treatment were as follows： soaking temperature 85℃， soaking time 24 h， under which the germination rate and germination potential were 80.00% and 95.56 %， respectively; treating with 98 % concentrated sulfuric acid for 10 ～30 min was the best， and the germination rate and germination potential reached 98.89 %～100.00 %.? The optimal medium for shoot induction was MS+ 6-BA1.0mg /L + NAA0.3mg /L. Conclusion： Hard seed coat causes dormancy and low germination rate， but embryo does not contain substances affecting germination. Albizia odoratissima （L.f.） Benth is a woody plant that is easy to induce shoots.

Key word：Albizia odoratissima （L.f.） Benth;seed coat breaking; tissue culture; shoot induction

香合歡（Albizia odoratissima （L.f.） Benth），又名牛角森、黑格，是豆科合歡屬的高大落葉喬木，其主要分布于海南、四川、廣東、廣西、貴州、云南，多垂直分布于海拔800 m以下的低山、丘陵的中下部，是廣西的鄉(xiāng)土樹種[1]。香合歡喜光，稍耐陰，較速生，心材比降香黃檀、格木成型更快。其幼齡時(shí)樹皮淺灰色，具有皮孔，長大后變?yōu)楹诤稚树[片狀脫落。香合歡幼枝密被絨毛，長大后絨毛脫落。其葉為二回羽狀復(fù)葉，葉柄基處有1枚腺體，小葉5～17對，基部偏斜，中脈明顯?；轭^狀花序，黃色，且芳香，果為莢果，種子近圓形，暗褐有光澤，堅(jiān)硬[2]。香合歡樹干通直，具有較高的觀賞價(jià)值，且具有較好的抗逆性，可作為園林行道樹使用。

香合歡木材美觀，紋理致密，材質(zhì)堅(jiān)硬而厚重，穩(wěn)定性強(qiáng)，干燥后不易開裂、變形，心材耐腐及抗蟲蛀能力強(qiáng)，是做上等家具、雕刻、建筑、造船等的絕佳材料。不僅如此，其樹皮含鞣質(zhì)12 %～15 %，可作為栲膠原料。香合歡具有耐旱、耐高溫、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，對改良土壤，改善生態(tài)環(huán)境具有良好的作用[3]。香合歡的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，又因其屬于豆科植物，有與根瘤菌共生的特性，因而對改良土壤改善林建生態(tài)環(huán)境具有重要的作用。

香合歡主要依靠種子繁殖，但由于其種子表皮堅(jiān)硬致密，吸水能力差，阻礙種子的萌發(fā)。且種子具有特殊氣味，容易引來昆蟲啃食，導(dǎo)致種子繁殖效率不高。因此，對香合歡進(jìn)行植物組織培養(yǎng)方面的研究，對合理開發(fā)利用香合歡具有重要的意義與價(jià)值。本文從香合歡硬實(shí)破除方法和香合歡的叢芽誘導(dǎo)2個(gè)方面對香合歡進(jìn)行研究，為下一步香合歡快繁提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所選用的種子為廣西百色市雅長林場于2019年1月18日采集的香合歡2號(hào)母樹成熟、飽滿的種子。

組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為1/2 MS，3/4 MS，MS培養(yǎng)基，均附加瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.8。

1.2 方法

將供實(shí)驗(yàn)的成熟香合歡種子用水選法剔除雜質(zhì)、蟲粒、不飽滿的種子后，在自來水下沖洗干凈，用于試驗(yàn)。

1.2.1 香合歡種子硬實(shí)破除方法

熱處理：將種子分別浸泡在盛有常溫水（25℃），60℃，70℃，85℃，100℃的燒杯中，加蓋自然冷卻，以將種子浸泡在常溫水（25℃）中作為對照，24 h后，將種子置于27℃，光暗各12 h交替的光照條件下進(jìn)行萌發(fā)測試，每組30粒種子，每組處理3次重復(fù)。

酸蝕處理：用98 %的濃硫酸處理0 min，5 min，10 min，20 min，30 min，處理的過程中需不停攪拌，防止種子碳化。處理后用清水沖洗至中性，置于吸水紙上晾干，將種子浸泡在盛有常溫自來水的燒杯中為對照，然后將種子置于27℃，光暗各12 h交替的光照條件下進(jìn)行萌發(fā)測試，每組30粒種子，每組處理3次重復(fù)。

種子開始萌動(dòng)時(shí)進(jìn)行記錄，每天觀察統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)，第5 d計(jì)算發(fā)芽勢，第10 d計(jì)算發(fā)芽率。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚芽長出，長度為種子長度的一半。以連續(xù) 5 d平均發(fā)芽率不足 1%的日期為統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率的日期。按標(biāo)準(zhǔn)GB 2772-81中規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)正常發(fā)芽粒數(shù)。3次重復(fù)未超出ISTA規(guī)程中規(guī)定的最大容許差距時(shí)，計(jì)算平均值作為有效試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 香合歡的叢芽誘導(dǎo)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氯化汞溶液會(huì)對已吸脹的種子造成一定程度的毒害作用，導(dǎo)致種子無法萌發(fā)或生長異常，因此，本實(shí)驗(yàn)中采用85 ℃熱水處理后，尚未吸脹的種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

用85 ℃熱水浸種24 h至自然冷卻。然后，挑選出尚未吸脹的種子，用干凈的濾紙吸干表面水分后放入75 %乙醇中滅菌，期間不時(shí)搖動(dòng)。30 s后取出，用無菌水沖洗2次，放入0.1 %氯化汞溶液中對外植體進(jìn)行滅菌10 min。隨后用無菌水沖洗5～6次。最后，用消毒濾紙吸干材料表面的水分后，將種子接種到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。之后，將長勢基本一致的無菌苗去除子葉及大部分下胚軸后，保留2 cm左右的芽，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)室條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1000～3000 lx，光照時(shí)間10 h/d。培養(yǎng)基按照三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置以下10種誘導(dǎo)培養(yǎng)基（見表1）。

每組處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，每瓶接種2個(gè)外植體。每7 d觀察1次，記錄好樣品形態(tài)的變化，28 d后統(tǒng)計(jì)外植體的叢芽誘導(dǎo)數(shù)、增值系數(shù)、有效外植體獲得數(shù)等情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從中篩選出適宜香合歡無菌實(shí)生苗叢芽誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

發(fā)芽勢（Gv）%=（5 d內(nèi)種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100

發(fā)芽率（Gr）%= （10 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100

叢生芽誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出叢生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100。

增值系數(shù)=分化芽數(shù)/接種芽數(shù)。

有效外植體獲得數(shù)：將較為健壯的叢芽切成2 cm左右?guī)?～2個(gè)芽點(diǎn)的小段進(jìn)行繼代。將轉(zhuǎn)接出的每1個(gè)外植體記為1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和新復(fù)極差法（Duncan法）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硬實(shí)破除方法對香合歡種子萌發(fā)的影響

由表2可看出，熱水和98 %濃硫酸處理均能在不同程度上促進(jìn)香合歡種子的萌發(fā)，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢均與對照組（常溫水處理）相比有不同程度的提高。不同處理間的發(fā)芽率存在顯著差異。熱水處理的種子，其發(fā)芽率存在著先升高后降低的現(xiàn)象，在60 ℃～85 ℃的浸種處理范圍內(nèi)，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均隨著水溫的升高而增加，并在85 ℃時(shí)達(dá)到最大值95.56 %和80.00 %，比對照提高83.34 %及72.22 %。當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，水溫使種胚受到損傷，容易發(fā)生腐爛的現(xiàn)象，種子的萌發(fā)受到影響，發(fā)芽率呈現(xiàn)下降趨勢。濃硫酸處理時(shí)，處理時(shí)間為20 min和30 min發(fā)芽率最高，達(dá)到了100 %，但與98 %濃硫酸處理10 min差異不顯著，與98 %濃硫酸處理5 min差異顯著，所以，98 %濃硫酸處理10～30 min在發(fā)芽率上取得的效果更好，并且此時(shí)發(fā)芽勢較高，達(dá)到了98.89 %～100.00 %，比對照組提高了91.11 %～92.22 %。綜合上述，對破除香合歡硬實(shí)的較好處理方式為85 ℃熱水處理24 h和98 %濃硫酸處理10 ～30 min。

2.2 不同培養(yǎng)基及外源激素濃度對叢芽誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)28 d，10種培養(yǎng)基上的叢芽誘導(dǎo)情況如表3所示。對單項(xiàng)指標(biāo)分析如下：

在叢芽誘導(dǎo)率方面，各處理間的差異達(dá)到顯著水平。與對照組（C0）相比，其他幾組對叢芽誘導(dǎo)均能取得較好的效果，但是，它們相互之間的差異不顯著。其中，C5的叢芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了96.67 %，比對照組提高了62.23 %。香合歡在不加任何激素的情況下，雖然也能夠誘導(dǎo)出一定數(shù)量的叢芽，但每叢為2～3個(gè)芽，數(shù)量并不多。而在添加激素后，叢芽誘導(dǎo)率顯著提升。其中C5，C6，C7，C8誘導(dǎo)效果較好，幾乎每叢均能誘導(dǎo)出每叢4～6個(gè)芽。這說明香合歡在以芽作為外植體時(shí)，容易誘導(dǎo)出叢芽，并且這些誘導(dǎo)出的芽均有較為明顯的高度增長。

在增值系數(shù)方面，各處理間的差異達(dá)到顯著水平。其中，C5，C6，C7，C8增值系數(shù)較高。但C7，C8誘導(dǎo)出來的芽在芽高增長量及健壯程度上比C5，C6更好。

在有效外植體獲得數(shù)方面，各處理間的差異達(dá)到顯著水平。即通過改變鹽濃度及激素含量，能夠?qū)τ行庵搀w獲得數(shù)產(chǎn)生一定的影響。其中，C5，C6，C7，C8與其他組存在顯著差異。盡管C5能獲得較多的外植體，但是在苗的質(zhì)量方面不及C6，C7，C8。

綜合所有指標(biāo)進(jìn)行分析，本試驗(yàn)認(rèn)為C7即MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.3 mg/L為最優(yōu)的叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

3 討論

種子休眠是植物進(jìn)化過程中長期適應(yīng)環(huán)境的一種重要的自我保護(hù)的方式[4]。導(dǎo)致種子休眠的原因有很多，硬實(shí)便是其中一個(gè)。硬實(shí)性是大多數(shù)豆科植物種子的特性，通過對豆科硬實(shí)種子解剖結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，硬實(shí)種子擁有堅(jiān)硬的表皮主要是由于其種皮具有發(fā)達(dá)的角質(zhì)層及廣泛發(fā)育的柵欄狀細(xì)胞與骨狀石細(xì)胞[5]。硬實(shí)性對于延長種子的壽命，促進(jìn)植物遠(yuǎn)距離傳播十分有利[6]。但是硬實(shí)性也阻礙了種子的萌發(fā)，未經(jīng)處理，會(huì)造成發(fā)芽率過低的情況。在本研究中，利用熱水和濃硫酸對香合歡進(jìn)行硬實(shí)破除。熱水處理主要是利用較高的水溫，使堅(jiān)硬的種皮龜裂成一種疏松多縫的狀態(tài)，以解除休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。而濃硫酸處理則是利用其強(qiáng)氧化性，腐蝕并破壞種皮結(jié)構(gòu)[7]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，熱水處理的最佳方案為85 ℃浸種24 h，發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別為80.00 %和95.56 %;用98 %濃硫酸處理較好的方案為濃硫酸處理10～30 min，通過這種方式可以實(shí)現(xiàn)香合歡發(fā)芽率和發(fā)芽勢達(dá)到98.89 %～100.00 %。由結(jié)果分析可知，造成香合歡種子休眠，萌發(fā)率較低的主要原因是：種皮阻礙水分進(jìn)入種子，影響種子的吸脹、萌發(fā)，而種胚本身并不含有影響其萌動(dòng)的物質(zhì)。在馮圓等對合歡硬實(shí)破除方法的研究中，采用不同水溫浸種及濃硫酸酸蝕的方法進(jìn)行種子的處理。當(dāng)水溫為50 ℃～60 ℃且浸泡時(shí)間為2 d時(shí)，種子的發(fā)芽率為97 %，發(fā)芽勢為90 %。當(dāng)酸蝕30 min+常溫水浸泡3 d時(shí)，發(fā)芽率及發(fā)芽勢為100 %和97 %[8]。可見，同科同屬的合歡及香合歡在種皮結(jié)構(gòu)上存在著一定的差異，因此，最佳的破除硬實(shí)方式會(huì)存在一定的不同。

植物組織培養(yǎng)是利用細(xì)胞全能性，進(jìn)而培育出完整植株體的一種技術(shù)[9]。通過這種方式，能夠更快速、高效地繁殖有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物。在本研究中香合歡叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為C7：MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.3 mg/L。具體表現(xiàn)為叢芽的誘導(dǎo)率及增值系數(shù)較高，每個(gè)叢芽的平均芽數(shù)較多且芽較壯，同時(shí)，有效外植體獲得數(shù)較多，與其他處理方式差異顯著，達(dá)到了快速繁殖試管苗，且節(jié)約材料和生產(chǎn)成本的目的。在國外對香合歡的組培研究中，以上胚軸作為外植體，最佳平均每個(gè)外植體誘導(dǎo)出15個(gè)芽。這種方式雖然誘導(dǎo)出的芽更多，但比本研究多經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)階段，耗費(fèi)的時(shí)間相對更長，且最佳愈傷組織誘導(dǎo)率為85.00 %，最佳芽誘導(dǎo)率僅為66.00 %[10]。通過這種方式對香合歡進(jìn)行組培，耗費(fèi)的生產(chǎn)成本相對會(huì)更高一些。外植體的選擇對組培效率有著重要影響，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行對比，篩選出更為快速經(jīng)濟(jì)的方式進(jìn)行植物組培。

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