梔子多糖的提取、體外抗氧化活性及免疫作用研究

王曉穎，王福琳，陸 遠(yuǎn)，岳輝瑩，韓茂森，周廣鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

梔子(Gardenia jasminoides Ellis )為茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)，收錄于《中華人民共和國藥典》(2015版)。具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效，外用消腫止痛。梔子果實(shí)系傳統(tǒng)中藥，亦屬衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，具有護(hù)肝、利膽、降壓、止血、清熱等作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)梔子中含有大量化學(xué)成分，主要包括環(huán)烯醚萜、三萜、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸脂、微量元素及多糖。研究證明多糖有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化[2-5]等多種作用，因此本文提取梔子多糖，并研究了其抗氧化與免疫促進(jìn)的活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

梔子購自寧夏華柯農(nóng)業(yè)生態(tài)開發(fā)有限公司，無水乙醇、苯酚、硫酸均為分析純，葡萄糖，抗壞血酸，DPPH試劑(福州飛凈生物科技有限公司，純度≥97%)，無菌雙蒸水，羥自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，RAW264.7細(xì)胞(購自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司)，PBS，胎牛血清。

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、LGJ-18 凍干機(jī)( 北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司) 、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國BioTek Instruments)。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子多糖正交提取工藝優(yōu)化

2.1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為優(yōu)化梔子多糖提取工藝，參考文獻(xiàn)[6-7]，適當(dāng)整理調(diào)整后，選取溫度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，各取三個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)(詳見表1)。每組實(shí)驗(yàn)均稱取10g梔子果實(shí)粉末，按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表的條件(表1)進(jìn)行提取，提取液濃縮后按2.1.2方法測定多糖含量。結(jié)果詳見表2。

表1 因素水平表L9(34)

2.1.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法，根據(jù)已有文獻(xiàn)[8-9]做適當(dāng)調(diào)整。精確吸取0.15mg/mL的對照品溶液0，0.1 ，0.3，0.5 ，0.7，0.9 mL于6只具塞試管中，分別加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，于上述試管中分別加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液，搖勻，再各加入濃硫酸5 mL，充分搖勻后靜置10 min，40℃下保溫15min，取出后迅速將其冷卻至室溫。于490 nm(最大吸收波長λmax)處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖濃度(x)和吸光度(y)的關(guān)系式為y= 11.967x+0.00243，R2=0.9993，表明葡萄糖在0.015～0.135mg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取供試品溶液1.0 mL于具塞試管中，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，自加入蒸餾水至2 mL起開始操作，測定吸光度，外標(biāo)兩點(diǎn)法測定多糖含量，計(jì)算多糖提取率。

2.1.3 提取工藝優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析詳見表2，方差分析詳見表3。比較表2中極差R及k值的大小可知，影響梔子多糖提取率的因素主次順序?yàn)椋篊>D>B>A。以R值最小的因素A(即溫度)作為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析[10]，可知因素C(即提取時(shí)間)、D(即提取次數(shù))具顯著性影響(P<0.05)，其余因素?zé)o顯著性影響(P>0.05)。通過對表1和表2的綜合分析，梔子多糖的最優(yōu)提取工藝為：A3B2C1D2，即溫度95℃，料液比1∶20，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)3次。在此最佳工藝條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，梔子多糖的提取率為27%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中其它組合項(xiàng)，表明該工藝可行，可作為梔子粗多糖的水提取工藝。采用熱水提取，80%乙醇沉淀，得梔子多糖樣品，用于下面的抗氧化和免疫活性實(shí)驗(yàn)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

表3 方差分析表

F0.05(2，2)=19.00 F0.01(2，2)=99.00

2.2 抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 DPPH自由基清除能力

根據(jù)朱新如等[11]的方法，適當(dāng)調(diào)整如下：精密稱量DPPH，用70%乙醇配制成80μg/mL的溶液。用70%乙醇配制成多個(gè)梯度濃度的樣品溶液(0，0.5，1，2，3，4mg/mL)，各取上述梯度濃度的樣品溶液1mL，分別加入DPPH溶液2mL，避光反應(yīng)30min，于517nm處測吸光度，平行測4次，結(jié)果取平均值，按照下面公式計(jì)算DPPH自由基清除率，另以70%乙醇作為空白，抗壞血酸(Vc)作陽性對照。結(jié)果見圖2，梔子多糖對DPPH自由基具有一定清除作用，但作用不強(qiáng)，在濃度2mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率為21.65%。

圖2 DPPH自由基清除作用

2.2.2 羥基自由基清除能力

Fenton反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生羥基自由基的化學(xué)反應(yīng)，消耗的H2O2的量和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH的量成正比，當(dāng)給予電子受體后，用Griess試劑顯色，生成紅色物質(zhì)，其呈色與·OH 的量成正比關(guān)系。因此，可使用多功能讀數(shù)儀在波長 550nm下測其吸光度，從而計(jì)算出提取物清除羥自由基的活力。

圖3 羥基自由基清除作用

用雙蒸水配置濃度梯度為2，4，8，10mg/mL的樣品溶液，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將已有的0.8mL反應(yīng)液在37℃下反應(yīng) 1 min，立即加入顯色劑2mL終止反應(yīng)，混勻，室溫放置20min后，雙蒸水調(diào)零，在550nm處測定吸光度。按照下面公式計(jì)算羥基自由基清除率。另以雙蒸水作為空白，抗壞血酸(Vc)作陽性對照(低濃度時(shí)羥基自由基清除率為39.41%)。結(jié)果如圖3，梔子多糖對羥基自由基具有一定清除作用，且其清除作用隨梔子多糖濃度的增大而增大，在濃度10mg/mL時(shí)羥基自由基清除率為70.97%。

2.2.3 清除超氧陰離子法測定抗氧化活性

模擬肌體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質(zhì)及gress氏顯色劑，使反應(yīng)體系呈現(xiàn)紫紅色，可用分光光度計(jì)測其吸光度。

用雙蒸水配置系列梯度濃度為0.5，1，2，4，8，10mg/mL的樣品溶液，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將現(xiàn)有的1.35mL反應(yīng)液充分混勻，37℃恒溫水浴40min，加入2mL顯色劑，混勻，靜置10min，雙蒸水調(diào)零，在550nm處測定吸光度A值。另以雙蒸水作為空白，抗壞血酸(Vc)作陽性對照。由圖4可知，梔子粗多糖對超氧陰離子自由基具有清除能力，并呈劑量依賴關(guān)系，其中濃度為10mg/mL時(shí)，抑制率為19.26%。

圖4 超氧陰離子抑制作用

2.3 RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖作用

圖5 梔子粗多糖對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

將RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于96孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的多糖溶液(50，100，200，400μg/mL)100μL，同時(shí)設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。恒溫培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，溫育4h后，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO，震蕩10 min后在570 nm 波長處測定其吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果見圖5，與空白組比較，在50～400μg/mL范圍內(nèi)的細(xì)胞存活率高于空白對照組，表明梔子多糖對RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用，其中濃度為400μg/mL時(shí)對細(xì)胞的增殖作用最大，細(xì)胞存活率為139.45%。

3 討論

采用水提法對梔子中所含的粗多糖進(jìn)行提取，通過進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定了溫度95℃，提取次數(shù)3次，料液比1∶20，提取時(shí)間2h為梔子多糖的最佳提取工藝條件，因素主次順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>提取次數(shù)>料液比>溫度。通過試驗(yàn)證明，該方法便捷有效，可為梔子多糖的進(jìn)一步研究作參考。

根據(jù)清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的實(shí)驗(yàn)可知，梔子多糖對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基皆具有一定的清除能力，但對于不同的自由基，其清除能力具有較大差距。其中，對羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，其次為DPPH自由基和超氧陰離子自由基。由此可知，梔子多糖具有一定的體外抗氧化活性。根據(jù)MTT法測定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可知，梔子粗多糖可促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)，其免疫作用隨著濃度的增大而增大，表明梔子多糖具有一定的免疫活性。