MMP-3抑制劑Ⅰ結(jié)合中等強度運動治療膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的效果

余艷梅 黃振 譚同才 程瑞動 邵玉玲 劉勇

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙為主要表現(xiàn)的常見骨關(guān)節(jié)病。在中國患病數(shù)已超過5 000萬，致殘率超過50%，嚴重影響患者的生活質(zhì)量?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）抑制劑能通過抑制MMP-3的表達水平來降低細胞外基質(zhì)的降解水平，從而修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨。但研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)其修復(fù)的軟骨細胞形態(tài)不均勻、膠原排列紊亂，軟骨基質(zhì)內(nèi)少量潮線形成，軟骨外觀形態(tài)雖然較好，但關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平較低，無法滿足膝關(guān)節(jié)的長期負重要求[1]。本研究觀察MMP-3抑制劑Ⅰ結(jié)合中等強度運動對KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)效果，報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 選擇3月齡雄性SD大鼠48只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供。大鼠按國家標準嚙齒類動物飼養(yǎng)，動物房室溫18～22℃，相對濕度40%～60%，每天的明暗時間各為12h，自由攝食、飲水，實驗之前均未行跑臺運動實驗及其他刺激。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分成正常組、模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組4組，每組12只。

1.2 主要試劑 碘乙酸鈉（批號：SLBG2033V）購自美國sigma公司；MMP-3抑制劑Ⅰ：金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑N-異丁基-N-（4-甲氧苯磺酰）-甘氨酰異羥肟酸（NNGH）購自美國Abcam公司；水合氯醛（批號：H37022673）購自青島宇龍海藻有限公司；甲醛（批號：DF0135）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸EDTA（批號：20171111）購自天津市化學(xué)試劑廠；ELISA試劑盒（批號：ab53015）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，DAB顯色試劑盒（批號：K152317J）購自北京中杉金橋公司。

1.3 實驗方法 模型組、抑制劑組、抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠采用關(guān)節(jié)腔注射的方式建立KOA模型大鼠[2]：腹腔注射10%水合氯醛0.3ml/kg，麻醉成功后在無菌條件下由髕腱外側(cè)向大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%碘乙酸鈉溶液50μ（l碘乙酸鈉1mg，稀釋于50μl 0.9%氯化鈉溶液中）。注射過程中3組大鼠均無不良反應(yīng)發(fā)生。建模成功后，抑制劑組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MMP-3抑制劑Ⅰ60μ（l高濃度2mmol/L），1次/周，共注射4周，注射后籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)、自由活動。抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠建模前先進行3d跑臺適應(yīng)訓(xùn)練，膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射MMP-3抑制劑Ⅰ（劑量、方法同上），4周后進行中等強度跑臺訓(xùn)練，持續(xù)6周。適應(yīng)訓(xùn)練：采用段氏PT2000型鼠類跑臺進行運動，坡度 0°，速度 10m/min，時間 10min，連續(xù) 3d。中等強度跑臺訓(xùn)練：上午8：00-12：00進行跑臺運動，參考Bedford等[3]的方法，坡度設(shè)定為5°，速度設(shè)定為18m/min，每次20min，運動1次/d，每周運動5d，共6周。運動中可選用聲音、小木棒強迫驅(qū)動等方式刺激大鼠持續(xù)運動，但運動過程中不用電刺激。正常組大鼠不作任何處理。

1.4 主要觀察指標

1.4.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察 4組大鼠同時進行試驗，10周完成上述試驗后，用頸椎脫位法處死各組大鼠取材，在抽取大鼠心臟血液后切開右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚和皮下組織，鈍性分離周邊肌肉，暴露右膝關(guān)節(jié)并切開，切取股骨遠端軟骨組織，置于10%甲醛溶液中固定24h，隨后浸于15%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣，4周后包埋切片，蕃紅O-固綠染色，光鏡下觀察，采用O’Driscoll組織學(xué)評分法[4]分析關(guān)節(jié)軟骨組織及軟骨細胞。

1.4.2 大鼠血清MMP-3表達水平測定 采用ELISA法。實驗前大鼠麻醉后，取尾靜脈血1.2ml，常溫下凝固，隨后在低溫環(huán)境中離心，2 000r/min，15min，獲得血清400μl，-80℃存儲。實驗完成后處死大鼠剖胸，心臟抽取血液1.2ml，按上述離心法獲取血清。血清檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。用酶標儀在450nm波長下測定檢測標本吸光度值（A值）。將標準品質(zhì)量含量作為水平坐標，將A值作為縱坐標，按照樣品A值在對應(yīng)曲線中的狀態(tài)，計算實驗前后MMP-3的表達水平，并計算相應(yīng)的差值，差值越大，提示關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)狀態(tài)越不理想。

1.4.3 關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平檢測 采用免疫組織化學(xué)法。軟骨切片脫蠟，梯度乙醇脫水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗，于4℃濕盒中孵育過夜。PBS沖洗后，加二抗，室溫下孵育30 min，加DAB顯色，自來水沖洗終止顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡下觀察并拍照記錄。采用Image-Proplus 6.0軟件，測定單位面積軟骨組織切片Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色平均A值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評分比較 實驗前模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組3組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評分組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），3組評分均低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；實驗后抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評分均高于模型組、低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；實驗后抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評分高于抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 實驗前后四組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評分結(jié)果（分）

2.2 各組大鼠血清MMP-3表達水平比較 實驗前模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組3組大鼠血清MMP-3表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），3組大鼠血清MMP-3表達水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；實驗后抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠血清MMP-3表達水平均低于模型組、高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；實驗后抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠血清MMP-3表達水平低于抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 實驗前后各組大鼠血清MMP-3表達水平比較（μg/L）

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平比較 實驗前模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平均低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；實驗后抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平均高于模型組、低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；實驗后抑制劑結(jié)合跑臺組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平高于抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

膝關(guān)節(jié)是主要的負重關(guān)節(jié)，在行走時其關(guān)節(jié)面承受的最大軸向作用力為體重的2.3～7.1倍[5]，前后方向的受力為體重的0.35～2.3倍[6-7]。較大的軸向作用力決定了膝關(guān)節(jié)需要結(jié)構(gòu)和功能俱佳的關(guān)節(jié)軟骨。

表3 實驗前后各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平比較

KOA病程中，主要病理特點是關(guān)節(jié)軟骨的不斷丟失[8]。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細胞組成。軟骨細胞外基質(zhì)的代謝平衡能維持軟骨的正常功能。膠原是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，關(guān)節(jié)內(nèi)部最重要的膠原是Ⅱ型膠原，其占據(jù)的比例超過了整體膠原的90%。造成關(guān)節(jié)失去生物力學(xué)特征的主要因素是Ⅱ型膠原和蛋白多糖的改變[9]，這種改變與KOA的病程存在密切的聯(lián)系。

研究表明，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨被破壞的關(guān)鍵因素是細胞外基質(zhì)的形成與降解失序[10]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是 MMP活性的特異性抑制劑。MMP-3是MMP的關(guān)鍵組成，對多糖具備充分的裂解活性[11]，在基質(zhì)降解過程中和軟骨破壞（特別是骨關(guān)節(jié)炎）的病理發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12-13]，所以MMP-3是造成關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵致病因素[14-16]。抑制劑Ⅰ和MMP-3分子共同形成的特殊復(fù)合物是MMP-3的抑制劑，可以高效抑制MMP-3的活性。正常情況下，兩者之間會維持平衡狀態(tài)，但在產(chǎn)生KOA的情況下，相應(yīng)細胞表達的MMP-3水平高于抑制劑Ⅰ，抑制劑活性降低，MMP-3活性有一定程度的提升[17]，造成了軟骨以及滑膜等產(chǎn)生退變甚至被破壞。本研究中，抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺組的大鼠注射了MMP-3抑制劑Ⅰ后血清MMP-3的表達水平降低，關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平提高，說明人為注射MMP-3抑制劑能夠降低MMP-3的表達水平來降低細胞外基質(zhì)的降解水平，從而修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨。但研究發(fā)現(xiàn)修復(fù)的軟骨中軟骨細胞形態(tài)不均勻、膠原排列紊亂，軟骨基質(zhì)內(nèi)少量潮線形成，軟骨外觀形態(tài)上雖較好，但關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平較低，失去了正常軟骨組織的特性及功能[13，18]，無法滿足膝關(guān)節(jié)長期的負重要求。有研究表明，適度活動可保持關(guān)節(jié)健康，過度活動會造成軟骨產(chǎn)生退變[19]；高強度運動[2，20]及長時間制動[21]均對關(guān)節(jié)不利。本研究結(jié)果顯示抑制劑組及抑制劑結(jié)合跑臺組的MMP-3表達水平相較于模型組都有所降低；抑制劑結(jié)合跑臺組的MMP-3表達水平相較于抑制劑組有明顯的降低，關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達水平相較于抑制劑組有明顯提高，說明關(guān)節(jié)運動對關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的表達有促進作用，可能機制如下：運動產(chǎn)生的關(guān)節(jié)滑液是關(guān)節(jié)軟骨營養(yǎng)的重要來源；運動可以減少關(guān)節(jié)粘連，增加關(guān)節(jié)周圍穩(wěn)定性，減少關(guān)節(jié)軟骨負荷，減少關(guān)節(jié)內(nèi)壓力，加快關(guān)節(jié)滑液的擴散，這讓軟骨修復(fù)具備一個更好的環(huán)境。但具體機制需要進一步研究。

另有學(xué)者對于在大量運動之后是否可以通過注射MMP-3抑制劑抑制MMP-3的高表達來預(yù)防軟骨損傷的問題作了進一步研究，此項研究也表明損傷后可依靠注射MMP-3抑制劑來加速機體的修復(fù)，但是這一研究未能探討以此為治療方案的可行性問題[22]。其余有關(guān)MMP-3抑制劑的分析也很少探討該問題。本研究為臨床KOA患者的治療和康復(fù)，尤其是遠期療效方面，提供了一個臨床思路和實驗證據(jù)。