脾破裂大鼠血清及回腸黏膜組織中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的變化及意義

賀強(qiáng)貴 謝先海 徐洪波 程水兵 吳廣宇 陶禮鈞

脾臟是腹部臟器中最容易受損的器官之一，外傷性脾破裂約占腹部臟器損傷的21%～38%[1]。脾破裂患者往往發(fā)生大出血，產(chǎn)生嚴(yán)重的缺血、缺氧，最終導(dǎo)致休克及多器官功能障礙綜合征（MODS），具有高發(fā)病率和高病死率的特征[2]。同時脾臟是人體最大的免疫器官，在機(jī)體的抗感染中起到重要作用。大量研究表明，脾臟全切除術(shù)后患者免疫功能顯著下降，可大大提升感染尤其是兇險(xiǎn)性感染的發(fā)生率，對患者生命構(gòu)成極大威脅[3]。臨床上，嚴(yán)重的創(chuàng)傷、燒傷、感染、休克等可直接損害腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，引發(fā)腸源性感染、全身性炎癥反應(yīng)綜合征，最終導(dǎo)致MODS的發(fā)生。腸黏膜屏障是防止腸道內(nèi)細(xì)菌移位最重要的功能和形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，緊密連接是腸上皮細(xì)胞最重要的細(xì)胞間連接，其結(jié)構(gòu)包括膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白[4]。緊密連接蛋白的閉合蛋白（Occludin）、密封蛋白-1 和緊密粘連蛋白-1（ZO-1）是構(gòu)成腸黏膜屏障的主要成分，其在腸上皮細(xì)胞中含量的變化與腸黏膜屏障功能密切相關(guān)[5]。本研究旨在探討Occludin和ZO-1在不同程度脾破裂大鼠腸黏膜中的含量及陽性表達(dá)的意義，以期為臨床上救治脾破裂患者時保護(hù)腸黏膜屏障提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 健康Wistar雄性大鼠48只，2～3月齡，體重300～400g,由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，按隨機(jī)數(shù)字表法分為脾破裂輕度組、中度組、重度組和假手術(shù)組（Sham組）4組，每組12只。

1.2 主要試劑和儀器 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供；Occludin一抗由中國Abcam公司提供；ZO-1一抗由中國Themo Fisher公司提供，二抗及免疫組化試劑盒均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；計(jì)算機(jī)圖像分析儀（Qwin）由德國Leica公司提供。

1.3 動物模型制作 4組大鼠術(shù)前均禁食、禁水6h，實(shí)驗(yàn)組予0.2ml 0.1%的戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉后取左肋緣下切口（1.5cm）進(jìn)腹，暴露脾臟，用手術(shù)刀片在脾臟膈面分別制作1道、2道、3道長約2cm、深約0.3cm的創(chuàng)面，分別對應(yīng)輕度組、中度組、重度組，完成后逐層關(guān)腹[6]；Sham組僅接受開、關(guān)腹手術(shù)。手術(shù)均在無菌操作下進(jìn)行。建模完成后，4組大鼠分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。4組大鼠均于造模24h后各留取3ml靜脈血作檢測標(biāo)本，并均于造模24h后用斷頭法處死，同時開腹取回腸中段約5cm腸管置于4%甲醛溶液中浸泡，留待檢測。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 大鼠腹腔情況觀測 檢測各組大鼠腹腔內(nèi)出血量，觀察腹腔滲出及腸管、脾臟情況。

1.4.2 血清Occludin及ZO-1含量檢測 采用ELISA法。取3ml靜脈血標(biāo)本經(jīng)肝素抗凝，樣品室溫下放置不超過1h，3 000r/min常溫離心10min，取上層血清液于-80℃液氮罐保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測按照說明書操作。

1.4.3 回腸組織病理學(xué)觀察 4組大鼠回腸標(biāo)本均制作病理切片并經(jīng)HE染色，光鏡下觀察黏膜組織的病理變化。

1.4.4 回腸黏膜組織中Occludin及ZO-1表達(dá)檢測采用免疫組化染色法。每只大鼠隨機(jī)取回腸組織切片2張，陽性染色均為胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，用計(jì)算機(jī)圖像分析儀觀察并分別測定其免疫反應(yīng)陽性區(qū)及其終末的平均光密度（optical density，OD）值，觀察 5個視野，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠腹腔內(nèi)情況 Sham組腹腔內(nèi)無滲出、出血，各臟器無異常。輕度組腹腔內(nèi)少許積血，平均約1.6ml，腸管顏色正常，脾臟創(chuàng)面少許滲出。中度組腹腔內(nèi)積血平均約3.5ml，腸管顏色較蒼白，脾臟創(chuàng)面滲出較明顯。重度組腹腔內(nèi)積血平均約4.3ml，腸管蒼白明顯，伴水腫，腸管間部分粘連，脾臟創(chuàng)面滲出明顯，并與周圍腸管粘連。

2.2 4組大鼠血清Occludin及ZO-1含量比較 4組大鼠血清中Occludin及ZO-1含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Sham組相比，中、重度組血清中Occludin及ZO-1含量均有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與輕度組相比，中、重度組血清中Occludin及ZO-1含量均有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表1。

2.3 4組大鼠回腸黏膜組織病理變化的比較 Sham組回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常（圖1a，插頁）。輕度組回腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，偶見絨毛充血水腫，無炎癥反應(yīng)、壞死、脫落（圖1b，插頁）。中度組腸黏膜絨毛數(shù)量減少，排列紊亂，可見部分細(xì)胞變性壞死，部分絨毛脫落，有多量炎性細(xì)胞浸潤（圖1c，插頁）。重度組回腸可見絨毛伏倒，部分絨毛尖端脫落，絨毛黏膜和黏膜下層間質(zhì)水腫，黏膜層可見大量中性粒細(xì)胞浸潤（圖1d，插頁）。

2.4 4組大鼠回腸黏膜組織中Occludin及ZO-1表達(dá)情況的比較 4組大鼠回腸黏膜組織中Occludin及ZO-1 OD值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Sham組相比，中、重度組Occludin及ZO-1 OD值均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與輕度組相比，中、重度組Occludin及ZO-1 OD值均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 2及圖 2、3（插頁）。

表1 4組大鼠血清中Occludin及ZO-1含量比較（ng/ml）

表2 4組大鼠回腸黏膜組織中Occludin及ZO-1表達(dá)情況的比較（OD值）

3 討論

腸道不僅是MODS的“受損”器官，又是MODS的“始動”器官，在嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、重度感染等應(yīng)激條件下，胃腸道最早容易發(fā)生缺血、缺氧損傷，產(chǎn)生腸源性感染，最終導(dǎo)致MODS及死亡。因此保護(hù)腸屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性是有效防治MODS的重要環(huán)節(jié)。緊密連接蛋白Occludin及ZO-1是構(gòu)成腸道黏膜屏障的主要成分，其在保證腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整中起著重要作用。研究表明在機(jī)體明顯應(yīng)激下緊密連接蛋白發(fā)生改變，導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞，細(xì)菌和毒素易位，最終導(dǎo)致腸源性感染的發(fā)生[7]。ZO-1是最早被發(fā)現(xiàn)的緊密連接蛋白，在腸道上皮存在多量表達(dá)，在緊密連接蛋白的形成與細(xì)胞骨架系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)中發(fā)揮重要作用[8]。ZO-1含量降低會導(dǎo)致腸道通透性增加，腸屏障功能降低，細(xì)菌移位，從而引起機(jī)體感染性疾病[9]。Occludin是構(gòu)成緊密連接的特異性蛋白，與ZO-1等蛋白相互結(jié)合調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)變化和血管通透性，維持腸黏膜屏障的正常功能。研究發(fā)現(xiàn)，塵螨的最主要抗原Derpl能夠水解Occludin蛋白，從而引起緊密連接的破壞和上皮滲透性的增加[10]。另有研究表明Occludin的減少和腸黏膜屏障功能的損傷密切相關(guān)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)失血性休克后30min腸道通透性和細(xì)菌、內(nèi)毒素移位增加，Occludin和ZO-l產(chǎn)生減少?？梢娋o密連接蛋白的改變，可能是燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷等應(yīng)激反應(yīng)后早期腸道屏障功能損害的一個重要機(jī)制。

脾臟在腹部受到外傷時容易發(fā)生脾破裂，引起腹腔大出血，危及生命。同時脾臟又是機(jī)體重要的免疫器官，具有抗感染、抗腫瘤等重要作用。脾臟損傷之后會導(dǎo)致機(jī)體免疫功能不同程度下降，容易并發(fā)各種感染。研究表明臨床脾破裂患者感染發(fā)生率約為10%～15%，而嚴(yán)重脾破裂患者感染發(fā)生率高達(dá)16%～22%，因重度感染造成的病死率高達(dá)5%[12]。陳琦等[13]的研究也表明感染是造成創(chuàng)傷性脾破裂患者高病死率的一個重要因素。張偉[14]的研究則表明對不同損傷程度的脾破裂患者采取合適的治療手段能夠降低感染發(fā)生率，提高搶救成功率。

臨床上，對于脾破裂患者的救治往往將重點(diǎn)放在采取手術(shù)還是非手術(shù)治療的方案上，而忽視了在整體救治過程中由于嚴(yán)重脾破裂出血導(dǎo)致的機(jī)體組織缺血、缺氧，腸黏膜屏障功能受損，細(xì)菌移位，同時脾臟功能受損，機(jī)體免疫功能下降，引起各種醫(yī)院感染的發(fā)生，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，并最終導(dǎo)致MODS的發(fā)生，而這有可能是嚴(yán)重脾破裂患者高病死率的重要病因之一。目前，國內(nèi)外的研究大都集中在嚴(yán)重的燒傷、重癥感染、腸梗阻、急性胰腺炎等引起的早期腸黏膜屏障損傷方面。張繼龍等[15]的研究證明急性腦出血早期即可出現(xiàn)腸屏障功能障礙，從而影響患者的預(yù)后。而關(guān)于外傷性脾破裂與腸黏膜屏障功能障礙之間關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究通過建立大鼠輕、中、重度脾破裂模型，檢測緊密連接蛋白Occludin和ZO-1在各組中的含量變化，并且綜合以上其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為輕度脾破裂因?yàn)閯?chuàng)傷應(yīng)激較輕，出血量少，大鼠機(jī)體能夠通過循環(huán)調(diào)節(jié)迅速代償，維持血容量穩(wěn)定及腸道正常血供，避免腸黏膜損傷或僅輕微損傷；而中重度脾破裂因?yàn)閯?chuàng)傷應(yīng)激相對較嚴(yán)重，出血量大，大鼠機(jī)體無法有效代償，造成腸道嚴(yán)重缺血、缺氧，腸黏膜屏障功能受到嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致腸黏膜明顯損傷，進(jìn)一步引起腸源性感染，最終導(dǎo)致MODS，危及生命。

綜上所述，大鼠血清中Occludin及ZO-1的含量變化能夠真實(shí)反映大鼠脾破裂后腸黏膜損傷的程度，這有望成為臨床上反映患者脾破裂后腸黏膜損傷程度的一個可靠指標(biāo)，有助于掌握脾破裂患者的腸黏膜屏障功能改變情況，及時對腸黏膜屏障進(jìn)行保護(hù)以盡量減少腸源性感染尤其是嚴(yán)重感染的發(fā)生，降低脾破裂患者的病死率。