赪桐葉中黃酮的提取及抗氧化活性的研究

黃麗華　陳詩(shī)敏　陳剛

摘 要：本試驗(yàn)研究赪桐葉中總黃酮的提取工藝及體外抗氧化活性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)化其總黃酮提取的工藝，并測(cè)定赪桐葉的黃酮的抗氧化能力。結(jié)果表明：赪桐葉的黃酮提取最佳工藝為乙醇濃度80%，料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間20min，赪桐葉片總黃酮提取率為4.13%;在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮總還原能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)黃酮濃度為1mg/mL時(shí)，黃酮對(duì)DPPH·和·OH的最大清除率分別為87.2%和86.5%，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：赪桐葉;黃酮;提取工藝;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

赪桐（Clerodendrum japonicum（Thunb.）sweet），又稱百日紅、貞桐花、狀元紅、荷苞花和紅花倒血蓮，為馬鞭草科赪桐屬多年生植物，花艷麗如火，花期長(zhǎng)[1]。在我國(guó)主要分布于廣東、廣西、貴州及臺(tái)灣等地，國(guó)外主要分布于日本、印度、馬來(lái)西亞等地區(qū)和國(guó)家。赪桐的根、葉可入藥，根具有祛風(fēng)利濕，散瘀消腫的功效，用于治療風(fēng)濕骨痛，腰肌勞損，跌打損傷，肺結(jié)核咳嗽、咯血等;葉具有解毒排膿的功效，可外用治療瘡癤腫[2]。赪桐根含有鞣質(zhì)、皂苷、黃酮類、酚類、香豆素與內(nèi)酯、三萜類和揮發(fā)油等化學(xué)成分[3]。前期研究表明，赪桐根水提取物對(duì)急慢性炎癥有抗炎的作用[4];通過(guò)對(duì)赪桐根中總黃酮的提取優(yōu)化[5]，表明赪桐根含有一定黃酮成分。黃酮是一種強(qiáng)抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基[3]。

目前對(duì)于赪桐葉的化學(xué)成分及有效成分的分析還比較缺乏，為了深度挖掘赪桐的潛在藥用價(jià)值，滿足地方藥用資源缺乏的迫切需要，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，篩選赪桐葉片總黃酮提取的條件，測(cè)定黃酮含量及黃酮總還原能力，并測(cè)定其清除DPPH·和·OH的能力，系統(tǒng)評(píng)估其抗氧化活性，旨在為赪桐葉中黃酮成分的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

赪桐新鮮葉片：采摘于肇慶學(xué)院生物園，烘干粉碎備用。

蘆丁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、亞硝酸鋁、磷酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸等，試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

電子天平（FA2004A，上海精科）;真空泵（ZKJ-1型，上海）;超聲波清洗器（KQ5100SD，昆山）;可見(jiàn)分光光度計(jì)（722型，上海精科）;干燥箱（ED-115型，上海一恒）等。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

赪桐葉片粉末→加入乙醇溶液→浸泡4h→超聲波提取→減壓抽濾→總黃酮提取液→進(jìn)行含量測(cè)定及抗氧化活性測(cè)定及分析[5]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)[6]

在維持其它條件不變的條件下，分別測(cè)定不同浸取液濃度（40%、50%、60%、70%、80%）乙醇、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶35，單位為g/mL）、提取時(shí)間（10min、20min、30min、40min、50min）各因素對(duì)黃酮含量提取的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)[7]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積濃度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)化總黃酮提取的工藝，并根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.4 赪桐總黃酮含量的測(cè)定

總黃酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測(cè)定，精確稱量10.0mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，用70%乙醇溶液溶解，并轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，定容至刻度，得到0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL于25mL容量瓶中，各加水6mL，加入5%NaNO2溶液0.7mL，搖勻，靜置6min;加5%Al（NO3）3溶液0.7mL，搖勻，靜置6min;加1.0mol/L NaOH溶液5mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置6min。在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密吸取赪桐葉總黃酮提取液0.5mL至25mL容量瓶中，加水6.0mL，按上方方法顯色后在510nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品溶液中總黃酮含量。

1.3 赪桐葉片總黃酮的抗氧化活性

1.3.1 黃酮總還原能力的測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度（0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL）的赪桐葉片總黃酮提取液2.5mL，加pH6.6的磷酸緩沖液（0.2mol/L）2.5mL及1%鐵氰化鉀1mL，50℃水浴20min，加10%三氯乙酸2.5mL，3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL蒸餾水、0.5mL 0.1%三氯化鐵，在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定其吸光度值[8]。

1.3.2 黃酮對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度（0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL）的總黃酮提取液各1mL于刻度試管中，加入0.04mg/mL DPPH甲醇溶液5mL，25℃條件下避光靜置60min，于517nm處測(cè)定吸光度Ax，以1mL 50%乙醇為空白測(cè)定吸光度A0，未加DPPH的樣品溶液測(cè)定吸光度Ax0[9，10]。DPPH·清除率通過(guò)公式計(jì)算：

DPPH·清除率/%=A0-（AX-AXO）A0×100%

1.3.3 黃酮對(duì)·OH清除能力的測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度（0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL）的總黃酮提取液各2mL于刻度試管中，再分別加入6mmol/L FeSO4、6mmol/L H2O2、6mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2mL，將其放入37℃水浴鍋中35min，待測(cè)液在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度Ax。以2mL去離子水為空白測(cè)得吸光度A0，未加入H2O2的溶液的吸光度為Ax0[11]。按以下公式計(jì)算·OH清除率：

·OH清除率/%=A0-（AX-AXO）A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)測(cè)定，由圖1得出回歸方程為Y=6.1339X+0.0045，R2=0.9994，在0～0.08mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)赪桐葉片總黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)赪桐葉片黃酮提取液的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，赪桐葉總黃酮得率隨著乙醇濃度增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，在乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮提取量最高達(dá)5.6%，乙醇濃度繼續(xù)增加，其總黃酮得率逐漸下降，乙醇濃度為80%時(shí)，總黃酮得率為4.5%。根據(jù)相似相溶原理，赪桐葉總黃酮的極性與70%的乙醇溶液相近，在中等乙醇濃度溶液中溶解度較高，在高乙醇濃度溶液中溶解度較低。因此，赪桐葉片黃酮提取最適宜乙醇濃度為70%。

2.2.2 料液比對(duì)赪桐葉片總黃酮得率的影響

料液比對(duì)赪桐葉片黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，赪桐葉總黃酮得率隨著液料比的增加而快速升高，當(dāng)液料比達(dá)到1∶25（g/mL）時(shí)，總黃酮得率最高達(dá)3.7%，再增加液料比時(shí)，總黃酮提取量緩慢下降。液料比小，提取液中赪桐葉總黃酮過(guò)飽和，提取量降低。液料比增加，溶液與物料中的黃酮濃度差增大，由溶解平衡原理可知，黃酮提取量增加。但液料比過(guò)大，可能會(huì)改變提取液極性而降低部分黃酮成分的溶解性，再增加液料比時(shí)，總黃酮提取量緩慢下降。因此，赪桐葉片黃酮提取最佳料液比為1∶25（g/mL）。

2.2.3 超聲提取時(shí)間對(duì)赪桐葉片總黃酮得率的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)赪桐葉片黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，赪桐葉總黃酮得率先隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)而升高，提取20min時(shí)總黃酮得率最高達(dá)2.6%，此后總黃酮提取量緩慢下降，但總體差異不明顯。因此，20min為適宜提取時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

本正交試驗(yàn)以赪桐葉片黃酮得率為結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)[2]。其中，所提取黃酮的得率受乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲提取時(shí)間（C）3個(gè)因素的交叉影響。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

從以上正交試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比計(jì)算得出極差R值，極差差異最大的是料液比，說(shuō)明料液比對(duì)赪桐葉片黃酮提取影響最顯著，其次是提取時(shí)間;極差最小的是乙醇濃度，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)赪桐葉片黃酮提取的影響最小。對(duì)比3個(gè)因素，主次排序?yàn)锽料液比>C提取時(shí)間>A乙醇濃度，超聲輔助提取赪桐葉片黃酮的最佳條件為A3B3C2，即80%的浸取液濃度、1∶30（g/mL）的料液比、20min的提取時(shí)間。

2.4 最佳提取條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳組合條件下進(jìn)行提取赪桐葉片總黃酮測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，所提取的黃酮得率為4.13%。3次平行測(cè)定得率均大于正交試驗(yàn)最佳組合所測(cè)得率3.94%，因此A3B3C2，即80%的乙醇濃度、1∶30（g/mL）的料液比、20min的提取時(shí)間為本試驗(yàn)的最優(yōu)組合。

2.5 赪桐葉片總黃酮提取液的抗氧化活性分析

2.5.1 赪桐葉片總黃酮提取液的總還原力

如圖5所示，試驗(yàn)采用Oyaizu法，通過(guò)觀察添加不同濃度的黃酮提取液后Fe3+和Fe2+之間的轉(zhuǎn)移來(lái)檢測(cè)樣品的還原能力，因?yàn)橐环N物質(zhì)的還原能力與其潛在的抗氧化活性關(guān)系密切。黃酮提取液具有一定的總還原力，隨著樣品濃度的增加，吸光度增大，兩者呈劑量依賴關(guān)系，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)[12，13]。樣品濃度（X）與吸光度（Y）間的回歸方程為Y=3.8609X+0.1456，R2=0.9999。

2.5.2 赪桐葉片總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除作用

由圖6可知，黃酮提取液對(duì)DPPH·有較強(qiáng)的清除作用，在質(zhì)量濃度為0.125～1.00mg/mL范圍內(nèi)隨著樣品濃度的增加，清除率逐漸增加，并呈明顯的量效關(guān)系，最大清除率為87.2%。

2.5.3 赪桐葉片總黃酮提取液對(duì)·OH的清除作用

在人體中，羥自由基是活性氧自由基的一種，因此測(cè)定總黃酮提取液對(duì)羥自由基清除率能反映出該物質(zhì)的抗氧化活性能力[3]。由圖7可見(jiàn)，赪桐葉片的總黃酮提取液對(duì)羥自由基的清除能力隨著濃度升高而增強(qiáng)。當(dāng)黃酮濃度為1mg/mL時(shí)，黃酮提取液對(duì)羥基自由基的清除率高達(dá)86.5%，證明其在體外抗活性氧基團(tuán)的能力強(qiáng)，抗氧化活性表現(xiàn)較明顯。

3 結(jié)論

上述研究可得知，浸取液濃度、料液比、浸取時(shí)間等因素對(duì)赪桐葉片黃酮的提取有一定的影響，且料液比影響較為顯著。通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)赪桐葉片中黃酮的工藝流程參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果最優(yōu)組合為乙醇濃度80%，料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間20min。最優(yōu)組合下赪桐葉片總黃酮提取率達(dá)4.13%。秦祖杰[5]的研究表明赪桐根中含有總黃酮的含量為0.66%，兩者比較表明，赪桐葉中的黃酮含量比根更為豐富。本研究所優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行、提取率高。

針對(duì)于赪桐葉子黃酮的研究鮮有報(bào)道，這不僅不利于對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究，還不利于對(duì)中國(guó)自然資源的再利用。通過(guò)對(duì)赪桐葉黃酮的研究，測(cè)定赪桐葉黃酮的活性，有助于了解其成分功效，開(kāi)發(fā)其潛在價(jià)值，研發(fā)出新的產(chǎn)品，將其工業(yè)化，擴(kuò)大赪桐潛在市場(chǎng)，并以此帶動(dòng)傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品和中藥材的附加價(jià)值再利用。

參考文獻(xiàn)

[1]吳懷恩，丘琴，陸海琳，等.赪桐的性狀與顯微鑒別[J].中藥材，2010，33（09）：1392-1394.

[2]?中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志（第65卷·第1分冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，1982：187-189.

[3]?秦祖杰，唐夢(mèng)瑩，梁潔，陳俊.赪桐根的化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)研究[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，14（03）：44-46.

[4]?陳俊，唐云麗，梁潔，等.赪桐根水提物抗炎作用研究[J]. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，16（2）：11-13.

[5]?秦祖杰，梁潔，孫正伊.赪桐根中總黃酮的提取工藝優(yōu)選[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（05）：60-62.

[6]?張榮山.藥物分析中正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析[J].張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000（04）：13-14.

[7]?吳清韓，李云，劉志聰，等.鳳凰單叢茶葉籽果皮和種皮總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2018，39（05）：166-170.

[8]?莫開(kāi)菊，柳圣，程超.生姜黃酮的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2006，27（9）：111-113.

[9]?Oyaizu M. Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography[J].Food composition and analysis，1988，35（11）：771-775.

[10]?[ZK（#]李巨秀，張小寧，李偉偉.不同品種石榴花色苷、總多酚含量及抗氧化活性比較研究[J].食品科學(xué)，2011，32（23）：143-146.

[11]?Smirnoff N， Cumbes Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry，1989，28（4）：1057-1060.

[12]?王靜，劉大川.紫（白）蘇葉黃酮類化合物抗氧化性能的研究[J].中國(guó)油脂，2004，29（3）：33-36.

[13]?張偉敏，魏靜，施瑞誠(chéng)，等.Noni 果的活性成分和生理功能研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19（6）：1087-1091.

（責(zé)任編輯 賈燦）