具有抗蛋白附著和再礦化功能的復(fù)合樹(shù)脂的初步研究

梅 美，楊 巍，馬永剛，張 寧

由于復(fù)合樹(shù)脂材料美學(xué)和力學(xué)性能的改進(jìn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于修復(fù)牙體缺損。填料成分和樹(shù)脂基質(zhì)的進(jìn)步改善了復(fù)合樹(shù)脂的性能[1]。研究表明，復(fù)合樹(shù)脂材料表面較其他修復(fù)材料更容易堆積菌斑[2]。菌斑產(chǎn)酸引起繼發(fā)齲，是充填材料脫落的主要原因[3]。唾液蛋白吸附于復(fù)合樹(shù)脂表面形成獲得性膜，是形成菌斑的先決條件[4]。如果復(fù)合樹(shù)脂具有抗蛋白附著功能，則可以有效地限制菌斑的形成和繼發(fā)齲的發(fā)生。甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC)是一類常見(jiàn)的具有抗蛋白附著和細(xì)菌粘附功能的生物復(fù)合物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床[5-6]。磷酸鈣復(fù)合樹(shù)脂是另一類改性復(fù)合樹(shù)脂材料的代表，其可以釋放超飽和態(tài)的鈣、磷離子使牙體硬組織的病損區(qū)域發(fā)生再礦化。通過(guò)霧化干燥技術(shù)合成的無(wú)定形磷酸鈣納米顆粒(nanoparticles of amorphous calcium phosphate,NACP)的粒徑大小僅有100 nm左右。NACP釋放的鈣、磷離子與傳統(tǒng)的磷酸鈣復(fù)合體相似，但是具有更優(yōu)的機(jī)械強(qiáng)度及性能[7]。本研究將MPC和NACP添加到復(fù)合樹(shù)脂中，從而研發(fā)出一種具有抗蛋白和再礦化功能的復(fù)合樹(shù)脂，并研究其對(duì)力學(xué)性能和菌斑生物膜的影響。

1 材料和方法

1.1 含有MPC和NACP的復(fù)合樹(shù)脂的制備 使用霧化干燥技術(shù)合成NACP。將碳酸鈣(美國(guó)Fisher公司)和無(wú)水磷酸氫鈣(美國(guó)Baker Chemical公司)溶解到乙酸中，以獲得終濃度分別為8 mmol/L和5.333 mmol/L的鈣離子和磷離子。Ca/P摩爾比為1.5，與無(wú)定型磷酸鈣(amorphous calcium phosphate,ACP)中一樣。將此溶液噴入到加熱的噴霧干燥裝置中，通過(guò)靜電沉淀器收集干燥的ACP納米顆粒(美國(guó)Air Quality公司)，獲得平均粒徑為116 nm的粉末狀NACP。雙酚A-甲基丙烯酸縮水甘油酯和雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯(美國(guó)Esstech公司)按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1∶1混合，并混入0.5%的光引發(fā)劑樟腦醌(camphorquinone,CQ)，從而構(gòu)成樹(shù)脂基質(zhì)[8]。根據(jù)以往研究，MPC(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)粉末以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的比例混入樹(shù)脂基質(zhì)中[9]。樹(shù)脂基質(zhì)與NACP，以及經(jīng)過(guò)硅烷化處理的無(wú)機(jī)填料(美國(guó)Caulk/Dentsply公司)按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為3∶2∶5混合[7-8]。添加MPC和NACP的復(fù)合樹(shù)脂作為實(shí)驗(yàn)組，商品化的復(fù)合樹(shù)脂Heliomolar(加拿大Ivoclar公司)作為對(duì)照組，根據(jù)商品說(shuō)明，其樹(shù)脂基質(zhì)成分與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2 力學(xué)性能的測(cè)試 應(yīng)用模具將復(fù)合樹(shù)脂制成尺寸為2 mm×2 mm×25 mm的長(zhǎng)方形試件。每個(gè)試件每個(gè)表面光固化1 min。試件在37 ℃蒸餾水中浸泡1 d后，使用萬(wàn)能材料測(cè)試機(jī)(美國(guó)MTS公司)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)[9-10]?？缍葹?0 mm，以1 mm/min的速度加力直到試件斷裂。彎曲強(qiáng)度按照公式3PmaxL/(2bh2)計(jì)算，其中P為斷裂時(shí)的載荷，L為跨距，b為試件的寬度，h為試件的厚度。彈性模量按照公式(P/d)[L3/(4bh3)]計(jì)算，其中d為線性彈性區(qū)域的斜率。每組6個(gè)試件。

1.3 抗蛋白附著性能的測(cè)試 對(duì)于抗蛋白和抗菌性能的測(cè)試，每個(gè)試件制成直徑10 mm、厚2 mm的圓柱型試件，制作時(shí)兩面用賽璐珞條形成光滑表面。每個(gè)試件每個(gè)表面光固化1 min，然后將試件浸入蒸餾水，攪拌1 h，以除去任何未固化的單體[9]。所有試件干燥并用環(huán)氧乙烷消毒(型號(hào)Anprolene AN 74i，美國(guó)Andersen Products公司)。

雙辛丁酸法測(cè)試試件表面蛋白的附著量[5-6,9]。每個(gè)試件在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中浸泡2 h，然后再將試件浸泡在濃度為4.5 g/L的牛血清蛋白溶液中(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，在37 ℃條件下浸泡2 h。將試件在PBS中漂洗5 min，然后將試件放入含有1%十二烷基硫酸鈉的PBS溶液中，超聲振蕩20 min[5-6,9]。應(yīng)用蛋白質(zhì)分析試劑盒(美國(guó)Fisher Scientific公司)測(cè)試PBS溶液中的蛋白質(zhì)濃度，從而計(jì)算附著在試件表面的蛋白質(zhì)的量。每組6個(gè)試件。

1.4 人唾液的收集和菌斑生物膜的形成 經(jīng)患者知情同意，簽署知情同意書(shū)。選擇10名擁有天然牙列，無(wú)活動(dòng)性齲病或牙周病的健康成年人作為唾液的捐贈(zèng)者。捐贈(zèng)人在過(guò)去的3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有使用過(guò)抗生素，捐贈(zèng)唾液前24 h不刷牙，并在捐贈(zèng)唾液前至少2 h禁飲食。捐贈(zèng)者在咀嚼封口膜的過(guò)程中收集分泌的刺激性唾液，并置于冰上。從每位捐贈(zèng)者的唾液樣本中取出等量的唾液混合，混合的唾液在無(wú)菌甘油中稀釋至終濃度為70%，儲(chǔ)存于-80 ℃[11]，用于體外培養(yǎng)人全菌菌斑生物膜。

混合唾液以1∶50的比例稀釋于McBain培養(yǎng)基中作為人全菌生物膜的接種液。McBain培養(yǎng)基中含有粘蛋白，2.5 g/L；細(xì)菌蛋白胨，2.0 g/L；胰蛋白胨，2.0 g/L；酵母提取物，1.0 g/L；氯化鈉，0.35 g/L；氯化鉀，0.2 g/L；氯化鈣，0.2 g/L；鹽酸半胱氨酸，0.1 g/L；血紅素，0.001 g/L；維生素K1，0.000 2 g/L，材料均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，pH值調(diào)整為7[12]。24孔培養(yǎng)板每個(gè)孔放入1個(gè)試件，各孔中加入1.5 mL接種液，在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。然后將試件轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。將試件轉(zhuǎn)移至新的24孔板中用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最終得到培養(yǎng)2 d的生物膜[9]。

1.5 生物膜活/死細(xì)菌染色 將培養(yǎng)2 d的試件在PBS中輕柔漂洗3次，用活/死細(xì)菌生存力試劑盒(美國(guó)Molecular Probes公司)進(jìn)行染色[8-9]。Syto 9將活細(xì)菌染色，產(chǎn)生綠色熒光；細(xì)胞膜受損的細(xì)菌會(huì)被碘化丙啶染色，產(chǎn)生紅色熒光；接近或重疊的死/活細(xì)菌會(huì)顯示出橙黃色。使用熒光顯微鏡(型號(hào)TE2000-S，日本Nikon公司)觀察染色的生物膜。每組6個(gè)試件，每個(gè)試件隨機(jī)選取3副圖，每組試件一共18副圖。

1.6 菌落形成單位(colony forming unit，CFU)計(jì)數(shù) 將培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜圓形試件轉(zhuǎn)移到2 mL試管中，通過(guò)超聲震動(dòng)收獲生物膜，再用渦旋混合震蕩儀(美國(guó)Fisher公司)混勻。使用3種瓊脂平板培養(yǎng)測(cè)定CFU：①用胰蛋白大豆血瓊脂培養(yǎng)板進(jìn)行全菌測(cè)定[12]；②用含有15%的蔗糖的輕型唾液鏈球菌瓊脂(mitis salivarius agar,MSA)培養(yǎng)板來(lái)進(jìn)行總鏈球菌測(cè)定[13]；③致齲性的變形鏈球菌對(duì)桿菌肽有抗藥性，桿菌肽常被用來(lái)從口腔菌群中分離變形鏈球菌[12]，用加0.2 U/mL的桿菌肽的MSA瓊脂培養(yǎng)板中來(lái)測(cè)定變形鏈球菌。

2 結(jié)果

2.1 力學(xué)性能和蛋白附著量比較 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的力學(xué)性能比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組的蛋白附著量顯著低于對(duì)照組(P=0.000)，大約是對(duì)照組的10%。表1。

表1 2組試件力學(xué)性能和蛋白附著量比較(n=6)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 CFU計(jì)數(shù)比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌的CFU計(jì)數(shù)均降低了約7倍，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表2。

表2 2組試件CFU計(jì)數(shù)比較(n=6)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 表面細(xì)菌粘附的定性比較 對(duì)照組表面覆蓋大量活細(xì)菌，呈綠色熒光，實(shí)驗(yàn)組雖然表面也呈綠色熒光，但是含量明顯低于對(duì)照組，圖1。

圖1 菌斑生物膜活/死細(xì)菌染色圖(n=6)

3 討論

口腔生物膜模型可以分為單一菌種、特定的混合菌和全菌模型3組[11]。從口腔環(huán)境中復(fù)制出來(lái)的全菌生物膜基本保持了口腔內(nèi)菌斑生物膜的復(fù)雜性和異質(zhì)性[12]。人唾液微生物中，鏈球菌在齲病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要的作用?？谇绘溓蚓喾N菌群，如變形鏈球菌群、唾液鏈球菌群等。許多研究已經(jīng)表明，變形鏈球菌是齲齒的主要致病菌[12]。變形鏈球菌組包含變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌等，都是重要的致齲菌。因此，體外培養(yǎng)口腔全菌生物膜，研究抗菌材料對(duì)菌斑生物膜的影響，對(duì)評(píng)價(jià)材料的性能及其臨床應(yīng)用前景非常重要。

本研究將MPC和NACP添加到復(fù)合樹(shù)脂中，對(duì)其力學(xué)性能、抗蛋白附著和抗細(xì)菌粘附效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組在不影響復(fù)合樹(shù)脂力學(xué)性能的前提下，顯著降低了蛋白附著量和細(xì)菌粘附量，因此添加了MPC-NACP的復(fù)合樹(shù)脂能夠有效減少蛋白質(zhì)的附著和細(xì)菌的粘附，從而抑制菌斑形成，能夠有效的對(duì)抗繼發(fā)齲。

菌斑是引起繼發(fā)齲的主要原因[3]，而蛋白質(zhì)的附著是細(xì)菌粘附和菌斑形成的先決條件[4]。因此，賦予復(fù)合樹(shù)脂抗蛋白附著功能可以有效地減少菌斑的形成。MPC具有較強(qiáng)的抗蛋白附著和抗細(xì)菌粘附的功能，其原因是由于MPC具有很強(qiáng)的親水性，在含水的MPC聚合物中有大量的游離水，而沒(méi)有結(jié)合水。結(jié)合水會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的附著，而游離水可以有效地抵抗蛋白質(zhì)的附著[5-6]。本研究結(jié)果顯示，含有MPC的復(fù)合樹(shù)脂具有較強(qiáng)的抗蛋白附著功能，其蛋白質(zhì)附著量約為對(duì)照組的10%。蛋白質(zhì)是細(xì)菌粘附的媒介[4]，由于實(shí)驗(yàn)組顯著降低了蛋白質(zhì)附著量，因此也明顯減少了細(xì)菌的附著。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌的3個(gè)CFU計(jì)數(shù)均降低了約7倍。生物膜活/死細(xì)菌染色顯示，實(shí)驗(yàn)組表面粘附的細(xì)菌量明顯低于對(duì)照組。

研發(fā)具有再礦化功能的磷酸鈣復(fù)合樹(shù)脂是對(duì)抗繼發(fā)齲的另一個(gè)有效途徑。傳統(tǒng)的磷酸鈣填料粒徑在1～55μm。這類復(fù)合樹(shù)脂能夠釋放鈣、磷離子，

使病損牙體組織再礦化。霧化干燥技術(shù)合成的NACP具有高的比表面積，粒徑約為100 nm。由此產(chǎn)生的納米復(fù)合樹(shù)脂能釋放大量的鈣、磷離子，同時(shí)機(jī)械強(qiáng)度是傳統(tǒng)磷酸鈣復(fù)合樹(shù)脂的近2倍。NACP復(fù)合樹(shù)脂有一定的“智能性”，它在酸性環(huán)境里會(huì)大量釋放出鈣、磷離子，也就是在牙最需要鈣、磷離子以對(duì)抗細(xì)菌產(chǎn)酸和防止齲壞發(fā)展的鈣、磷離子最佳釋放時(shí)機(jī)。將NACP復(fù)合樹(shù)脂浸泡在pH值為4的酸性溶液里，它將會(huì)迅速中和酸，將pH值升高到6左右的安全范圍內(nèi)，而成品的復(fù)合樹(shù)脂修復(fù)材料不會(huì)對(duì)pH值為4的酸性環(huán)境發(fā)生任何影響[7-8]。本研究同時(shí)添加MPC和NACP到復(fù)合樹(shù)脂中，能夠起到抗蛋白附著，抗細(xì)菌粘附，中和酸和促進(jìn)再礦化的作用。這種添加雙重有效成分(MPC是抗蛋白附著成分，NACP是再礦化成分)的方法具有廣泛的應(yīng)用前景。