PEG-6000 模擬干旱脅迫下高粱種子萌發(fā)期抗旱、敏感材料篩選、鑒定

王平，王春語，叢玲，張麗霞

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，遼寧沈陽(yáng)110161）

干旱是農(nóng)作物種植過程中經(jīng)常面臨的非生物逆境之一，從播種到結(jié)實(shí)作物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，缺雨或天氣炎熱等造成的干旱脅迫都會(huì)影響作物生長(zhǎng)，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕產(chǎn)。高粱為C4植物，基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，且用途多樣，抗逆性強(qiáng)，因此對(duì)其研究日益廣泛和深入［1］。

高粱抗旱性極強(qiáng)，已成為探究植物抗旱分子機(jī)制、挖掘抗旱相關(guān)基因的重要模式生物［2］。高粱抗旱相關(guān)研究多集中在干旱脅迫處理前后其形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理指標(biāo)的變化［3，4］。近年來相繼定位到一些抗旱相關(guān)QTLs，但多數(shù)與開花前和開花后抗旱性有關(guān)，包括Stg1、Stg2、Stg3、Stg4、PfrC、PfrE、PfrF和PfrG等［5～7］。然而高粱從用途角度可分為甜高粱、粒用高粱、飼草用高粱和帚用高粱等，不同類型材料間因農(nóng)藝性狀差異導(dǎo)致抗旱能力有所不同。在高粱種質(zhì)資源抗旱性鑒定中，通常忽略了不同用途類型、株高和熟期之間抗旱能力的差別，在同一試驗(yàn)條件下混合比較，如在種子萌發(fā)期高粱抗旱材料篩選試驗(yàn)中，選用了保持系、恢復(fù)系和雜交種作為抗旱的篩選材料，最終選出的高粱種子萌發(fā)期抗旱性強(qiáng)的材料，因材料類型，熟期和株高都不同，很難對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室的篩選鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。高粱每個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期抗旱性均可能存在顯著差異，如B35 開花前期對(duì)干旱敏感，開花后期抗旱，而在種子萌發(fā)期抗旱性中等［8，9］，因此如不限定材料類型、生長(zhǎng)發(fā)育階段和株高等相關(guān)農(nóng)藝性狀是無法高效篩選出抗旱和敏感材料。

種子萌發(fā)期是高粱生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)高粱群體數(shù)量和結(jié)構(gòu)起決定作用。干旱條件下，高粱出苗情況依賴于發(fā)芽速度和整齊度，這取決于種子在低水分條件下的發(fā)芽能力［10，11］。近年來北方高粱主產(chǎn)區(qū)春季播種期間多風(fēng)少雨，種子在萌發(fā)期飽受干旱襲擾，因此萌發(fā)期的抗旱性尤為重要。然而，基于同一材料類型、綜合篩選萌發(fā)期高粱抗旱材料的研究報(bào)道較少。為了提高抗旱和干旱敏感材料的篩選效率和準(zhǔn)確性，本研究對(duì)收集的575 份材料通過PEG-6000 模擬干旱條件篩選種子萌發(fā)期同一類型、熟期和株高相近，但抗旱性顯著不同的高粱材料，為挖掘種子萌發(fā)期抗旱基因群體構(gòu)建奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從全球高粱產(chǎn)區(qū)收集到不同用途高粱材料，包括甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和農(nóng)家種等，共計(jì)575 份。

1.2 試驗(yàn)方法

選取籽粒飽滿、均勻一致且無病蟲害的種子100 粒，均勻平鋪于墊有3 層濾紙的發(fā)芽盒（10 cm×10 cm×7 cm）中，分別加入15 mL 純凈水或不 同 濃 度 的 PEG - 6000（15%、17.5%、20%、22.5%、25%）水溶液，置于人工氣候室28 ℃處理10 d（16 h Light/8 h Dark）后，出苗以 2 片子葉變綠展開為準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)種子的（相對(duì)）出苗率。

出苗率=（種子的實(shí)際出苗株數(shù)/種子總粒數(shù)）×100%

相對(duì)出苗率=（處理后種子的實(shí)際出苗率/對(duì)照種子出苗率）×100%

試驗(yàn)重復(fù)3 次，求平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下：（相對(duì)）出苗率一級(jí)：80%～100%；二 級(jí) ：60%～79.99%；三 級(jí) ：40%～59.99%；四 級(jí) ：20%～39.99%；五 級(jí) ：0%～19.99%。

1.3 農(nóng)藝性狀測(cè)定

供試材料連續(xù)3 年（2015-2017 年）種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院沈陽(yáng)試驗(yàn)基地用于農(nóng)藝性狀測(cè)定。播種后，當(dāng)小區(qū)50%高粱幼芽“露錐”時(shí)直至本小區(qū)50%的植株穗從旗葉鞘中抽出的天數(shù)記錄為抽穗期（d）。植株達(dá)到完熟期，隨機(jī)選取5 株用直尺測(cè)量植株自地表到穗頂?shù)母叨扔涗洖橹旮撸╟m）。收獲脫粒后目測(cè)籽粒顏色和籽粒大小。籽粒顏色分為4 種，包括白色、黃色、橙色和紅色。籽粒大小分為小粒、中粒和大粒3 種類型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析

用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)并計(jì)算不同PEG-6000濃度梯度處理后種子的（相對(duì)）出苗率的平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤以及圖形繪制。用SPSS 20.0 進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)期出苗率

不同高粱材料之間在正常情況下出苗率存在較大差異，本身出苗率的高低將影響高粱種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的準(zhǔn)確性。575 份高粱材料在水培養(yǎng)條件下，出苗率達(dá)到一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)和五級(jí)的樣品數(shù)分別為 488 份、62 份、18 份、5 份和 2份，分別占總樣品比例為84.87%、10.78%、3.13%、0.87%和0.35%。其中，488 份出苗率達(dá)到一級(jí)的高粱材料中，出苗率介于80%～89.99%共有142 份，出苗率介于90%～100%共有346 份，分別占總樣品比例為24.7%和60.17%。346 份材料中，3 次重復(fù)試驗(yàn)出苗率均≥90%的材料共計(jì)301 份，這些材料將用于進(jìn)一步抗旱和敏感材料篩選、鑒定。

2.2 種子萌發(fā)期高粱抗旱和敏感材料篩選

根據(jù)前期的研究經(jīng)驗(yàn)［9］，選擇 17.5% PEG-6000 模擬干旱脅迫作為抗旱和敏感材料的篩選濃度篩選301 份高粱材料。在此模擬干旱脅迫條件下，相對(duì)出苗率達(dá)到一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)和五級(jí)的樣品數(shù)分別為 63、161、51、26 和 0 份，分別占總樣品比例為20.93%、53.49%、16.94%、8.64%和0%。

17.5% PEG-6000 脅迫處理后，其中26 份材料的相對(duì)出苗率顯著降低（＜40%），為了篩選到對(duì)模擬干旱脅迫更加敏感的材料，適度降低選擇壓力。15% PEG-6000 處理后，26 份材料中 11 份材料相對(duì)出苗率在80%～86.5%之間，15 份材料相對(duì)出苗率在70%～79.5%之間。結(jié)果表明，這26 份材料對(duì)模擬干旱脅迫極為敏感，可作為種子萌發(fā)期敏感的材料。

17.5% PEG-6000 脅迫處理后，63 份材料相對(duì)出苗率≥80%，為了篩選到抗旱性更強(qiáng)的材料，增加選擇壓力，采用20% PEG-6000 進(jìn)一步篩選。其中15 份材料相對(duì)出苗率在80%～90.5%之間，19份材料相對(duì)出苗率在62.5%～78.5%之間，29 份材料相對(duì)出苗率＜60%。選擇20% PEG-6000 脅迫下，相對(duì)出苗率≥62.5%的34 份材料作為種子萌發(fā)期的抗旱材料。

2.3 分類分析高粱種子萌發(fā)期抗旱和敏感材料

為了減少籽粒大小、籽粒用途、株高和生育期等性狀對(duì)模擬抗旱鑒定的影響，利用株高和熟期對(duì)材料進(jìn)行分類。26 份敏感材料中，8 份在沈陽(yáng)不能正常抽穗結(jié)實(shí)，18 份材料可以正常抽穗結(jié)實(shí)。34 份抗旱材料中，12 份在沈陽(yáng)不能正常抽穗結(jié)實(shí)，22 份材料可以正常抽穗結(jié)實(shí)。統(tǒng)計(jì)沈陽(yáng)地區(qū)3 年的株高和生育期數(shù)據(jù)，以此為選擇參數(shù)，將18 份敏感材料和22 份抗旱材料進(jìn)行篩選，選擇抽穗期差異3 d 以內(nèi)，株高差異5 cm 以內(nèi)，共篩選到3 組抗旱和干旱敏感的材料（圖1）。3 個(gè)組合中共包含8份材料，分別統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀（表1）。組合1 中8R336（抗旱）和8R079（干旱敏感）均表現(xiàn)為抽穗期早、株高矮，且均為粒用高粱，可以作為優(yōu)良親本構(gòu)建抗旱相關(guān)基因定位群體。組合2 中，8R199（抗旱）和8R601（干旱敏感）雖然株高和抽穗期接近，但是籽粒用途不同。組合3 中，抗旱和敏感的材料分別都有2 份，其中敏感材料8R141（干旱敏感）是粒用高粱，其它3 份為糖用高粱，抽穗期晚且植株偏高。組合1 中2 份粒用高粱和組合3 中3 份糖用高粱可以用于挖掘抗旱基因的群體構(gòu)建。

圖1 依據(jù)株高和抽穗期篩選22 份抗旱材料和18 份敏感材料Fig.1 Screening graph for 22 drought-resistant materials and 18 drought-sensitive materials based on plant height and heading date

2.4 不同選擇壓下種子萌發(fā)期抗旱性精細(xì)鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果，利用不同脅迫處理對(duì)組合1 和組合3 中3 份抗旱材料（8R336/8R340/8R481）和 2 份敏感材料（8R079/8R078）抗旱性進(jìn)行精細(xì)鑒定（圖2）。15%和17.5%PEG-6000 脅迫處理下，脅迫處理對(duì)抗旱材料的相對(duì)出苗率影響較小，與對(duì)照相比下降幅度較低，8R336、8R340 和8R481 相對(duì)出苗率降低幅度分別為0.67%～6.34% 和 1.34%～11%。當(dāng) PEG-6000 處理濃度≥20%時(shí)，抗旱材料相對(duì)出苗率下降達(dá)到顯著水平。然而與對(duì)照相比，15% PEG-6000 脅迫處理下，干旱敏感材料8R079 和8R078 的相對(duì)出苗率下降幅度為13%～21.5%達(dá)到顯著水平，隨著處理濃度的不斷增大，相對(duì)出苗率下降幅度更大達(dá)到極顯著水平。

組內(nèi)抗旱材料和敏感材料比較，在正常水培養(yǎng)條件下，兩者出苗率均達(dá)到90%以上且差異很小，變化范圍為1.83%～2.67%。但是經(jīng)過15%PEG-6000 處理后，抗旱材料和敏感材料之間差異明 顯 ，8R336/8R079、8R340/8R078 和 8R481/8R078 相對(duì)出苗率分別相差21.5%、15% 和8.33%，抗感材料相比較相對(duì)出苗率降低幅度均達(dá)到顯著水平。PEG-6000 處理濃度≥17.5%時(shí)，干旱敏感和抗旱材料之間的相對(duì)出苗率差異更大達(dá)到極顯著水平。當(dāng)處理濃度增加到25%時(shí)，抗旱和敏感材料相對(duì)出苗率都很低，且兩片子葉不能完全展開，不利于出苗率的統(tǒng)計(jì)。根據(jù)相對(duì)出苗率統(tǒng)計(jì)分析，8R336/8R079（38%、45.33%）和8R340/8R078（53%、55%）雜交親本在 17.5% 和20% PEG-6000 脅迫處理下相對(duì)出苗率差異更大利于統(tǒng)計(jì)分析，可以作為最優(yōu)雜交組合構(gòu)建基因定位群體。

表1 抗旱和敏感材料農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)Table1 Statistic analysis of agronomic characters of drought-resistant and sensitive materials

圖2 不同濃度PEG-6000 處理下，5 份高粱材料相對(duì)出苗率統(tǒng)計(jì)Fig.2 Relative seedling-emergence rates of five sorghum materials in the treatments with different PEG-6000 concentrations

3 討論

植物抗旱性是一個(gè)綜合性狀，受遺傳因素和環(huán)境條件等多重影響，在各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段植物表現(xiàn)出的抗旱能力存在顯著差異，有些品種整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期抗旱性基本不變，有些品種不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期存在顯著差異，因此明確適合作物某個(gè)發(fā)育時(shí)期或全生育期的抗旱篩選方法非常重要。高粱抗旱性研究，多數(shù)集中在開花前后和苗期［12，13］，關(guān)于種子萌發(fā)期高粱抗旱性研究相對(duì)較少。然而高粱春播遭遇干旱時(shí)，萌發(fā)期抗旱性就顯得尤為重要，直接決定出苗率和群體結(jié)構(gòu)的建立。

借鑒玉米、小麥和水稻等作物的研究經(jīng)驗(yàn)［14～16］，高粱也采用種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)抗旱指數(shù)等作為萌發(fā)期抗旱篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)。陳冰嬬等［17］以 15 份保持系、18 份恢復(fù)系和8份雜交種為材料，以PEG-6000 水溶液模擬干旱脅迫，篩選出2 份萌發(fā)期抗旱性強(qiáng)的高粱材料，分別為恢復(fù)系L116 和保持系 Ms27B。吳奇等［4］、王藝陶等［18］分別利用54 份、31 份高粱雜交種篩選種子萌發(fā)期抗旱的材料，最終分別獲得一個(gè)抗旱性極強(qiáng)的雜交組合13218A×20982R 和4 個(gè)高度抗旱材料。張笑笑等［19］利用73 份高粱材料對(duì)萌發(fā)期和苗期的抗旱性進(jìn)行篩選，通過室內(nèi)和田間試驗(yàn)，最終篩選出抗旱材料1 份、敏感材料2 份。

PEG-600 是一種極為理想的滲透調(diào)節(jié)劑，可有效降低栽培基質(zhì)中水勢(shì)，穩(wěn)定滲透壓，廣泛用于種子萌發(fā)期模擬干旱脅迫試驗(yàn)［20］。本研究團(tuán)隊(duì)前期在PEG-6000 模擬干旱的情況下，對(duì)全球收集的396 份高粱材料進(jìn)行抗旱篩選，根據(jù)種子萌發(fā)期相對(duì)出苗率的高低為指標(biāo)篩選出了4 份抗旱材料［9］，但是由于篩選群體不夠大，在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下有很高的出苗率，模擬干旱脅迫處理后，出苗率顯著降低的材料不易篩選到。本試驗(yàn)中，將篩選群體擴(kuò)大到575 份，同時(shí)選擇不同的模擬干旱脅迫壓力篩選抗旱和敏感材料。當(dāng)選用的PEG-6000 濃度為17.5%，301 份高粱材料模擬干旱脅迫處理后，相對(duì)出苗率≥80%的抗旱材料共有63 份，相對(duì)出苗率＜40%的敏感材料共有26 份；當(dāng)PEG-6000濃度降低到15%時(shí)，26 份敏感材料中11 份材料相對(duì)出苗率在80%～86.5%之間，15 份材料相對(duì)出苗率在70%～79.5%之間，不論是抗旱材料還是敏感材料相對(duì)出苗率都很高，15%PEG-6000 不適于極端材料的篩選。當(dāng)PEG-6000 濃度增加到20%時(shí)，63 份抗旱材料中相對(duì)出苗率≥80%的只有15 份。本試驗(yàn)中，干旱敏感材料并沒有只選擇在15% PEG-6000 脅迫處理下相對(duì)出苗率在70%～79.5%之間的15 份材料，抗旱材料也沒有只選擇在20% PEG-6000 脅迫處理下相對(duì)出苗率≥80%的15 份材料，主要是由于篩選到的極端材料太少，綜合考慮株高、抽穗期（在沈陽(yáng)能否正常抽穗結(jié)實(shí)）、用途和籽粒大小等性狀時(shí)，存在可能篩選不到理想的抗旱和干旱敏感材料用于基因定位群體的構(gòu)建。綜上所述，當(dāng)篩選材料群體大時(shí)，重點(diǎn)篩選抗旱材料時(shí)，建議PEG-6000 濃度使用20%；重點(diǎn)篩選敏感材料時(shí)，建議PEG-6000 濃度使用17.5%。

通常情況下，PEG-6000 處理模擬的是水分滲透脅迫，與實(shí)際的土壤干旱脅迫不完全相同。因此，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用PEG-6000 模擬干旱脅迫篩選、鑒定獲得的干旱敏感材料和抗旱材料，都需要在大田中進(jìn)行多年多點(diǎn)試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證，將來才有可能為高粱種子萌發(fā)期抗旱育種提供一定的依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）575 份高粱材料在28 ℃水培條件下，出苗率達(dá)到一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)和五級(jí)的樣品數(shù)分別為 488 份、62 份、18 份、5 份和 2 份。

（2）3 次重復(fù)試驗(yàn)出苗率都達(dá)到90%以上的材料共有 301 份，經(jīng)過 17.5% PEG-6000 處理后，篩選到抗旱材料34 份，敏感材料26 份。

（3）去除光溫敏感材料后，篩選到抗旱材料22份，敏感材料18 份，共計(jì)40 份。選擇抽穗期差異3 d 以內(nèi)、株高差異5 cm 以內(nèi)，共篩選到3 組適于雜交的材料，包括抗旱和敏感材料共計(jì)8 份。

（4）綜合考慮株高、抽穗期、用途和模擬干旱脅迫下相對(duì)出苗率的差異大小等因素，8R336/8R079 和8R340/8R078 作為最優(yōu)雜交組合構(gòu)建抗旱相關(guān)基因定位群體。