糖酸類化合物的解磷機理研究

白旭皓 楊洋 董永華

關(guān)鍵詞：葡萄糖酸;2-酮基葡萄糖酸;木糖酸;磷酸鈣;磷酸鎂;解磷機理

磷是植物生長中不可或缺的三大元素之一[1]，是植物體內(nèi)結(jié)構(gòu)化合物的重要組成元素，可參與細胞的物質(zhì)運輸、信息交流和能量交換等生命活動，如果在植物生長過程中缺少磷元素，會影響細胞的分裂增殖和其他生命活動[2]。磷具有極強的化學(xué)反應(yīng)性，使得土壤中的磷元素多以難溶性磷酸鹽的形式存在，導(dǎo)致磷在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍缺乏[3]。施用可溶性磷酸鹽是為植物提供磷的主要途徑，但是由于磷酸根易與土壤中的鈣、鎂等其他金屬離子形成難溶性化合物而固定在土壤中，降低了磷的使用效率。據(jù)統(tǒng)計，約有80%的磷肥最終轉(zhuǎn)化為難溶性化合物而無法被植物吸收利用[4]。因此，減少磷的沉淀、增加土壤中有效磷的含量，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期關(guān)注的研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在的細菌[5]、真菌[6]、放線菌[7]等多種微生物的代謝物可以將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性形態(tài)。關(guān)于微生物的溶磷機制，主要有氫質(zhì)子交換[8]、螯合理論[9]、磷酸酶蛋白理論[10]和氧化還原理論[11]。合成有機酸是微生物溶磷的重要化學(xué)基礎(chǔ)，而具有合成葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸能力的微生物通常具有優(yōu)良的溶磷效果[12-15]。利用微生物溶解土壤中的難溶性磷酸鹽不僅綠色可持續(xù)，而且成本較低，具有較高的應(yīng)用價值?？死撞戏窝讞U菌（Klebsiella pneumoniae）屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬，廣泛存在于水、植物、土壤及動物中，是重要的根際微生物[16-18]。該菌種生長繁殖速度快、代謝旺盛、代謝產(chǎn)物豐富，是一種重要的工業(yè)微生物[19]。克雷伯氏肺炎桿菌等微生物中存在1條直接氧化葡萄糖的途徑，該途徑位于細胞的周質(zhì)空間，葡萄糖經(jīng)過氧化形成葡萄糖酸，葡萄糖酸進一步氧化形成2-酮基葡萄糖酸。在酸性條件下培養(yǎng)克雷伯氏肺炎桿菌，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中積累了大量2-酮基葡萄糖酸[20]。此外研究發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖酸脫氫酶失活突變株為生產(chǎn)菌株可以合成大量葡萄糖酸[21];以木糖為底物可以合成相應(yīng)的木糖酸[22];以生物質(zhì)水解液等為底物，可以獲得葡萄糖酸和木糖酸的混合物。

不同于利用微生物進行解磷效果研究的工作[23-25]，本研究利用克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵法制備糖酸類化合物，對糖酸類化合物與鈣離子、鎂離子形成的配合物進行研究，根據(jù)圖 1的解磷機制（糖酸根離子與鈣離子形成配合物，減少了游離鈣離子，進而使磷酸鈣溶解平衡向右移動，使磷酸根的溶解度增大），測定配合物的穩(wěn)定常數(shù)，以定量確定這些糖酸類化合物通過與金屬離子形成配合物進而溶解磷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤取自上海市浦東新區(qū)?？坡反ㄑ蠛优?，除去表層垂直厚度約為5 cm的土壤，并除去植物殘根、石塊等雜物，用潔凈的塑料袋儲存。2-酮基葡萄糖酸鈉和木糖酸鈉由筆者所在實驗室發(fā)酵制備;其他化學(xué)試劑均為分析純商業(yè)產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

pH電位計，德國賽多利斯;小型高速離心機、高速離心機，德國Eppendorf;ZWY-2102C恒溫振蕩搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;PXS-270型離子計、鈣離子電極，雷磁上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;ZDP-A2160A全自動新型電熱培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司;Biostat A Plus發(fā)酵罐，德國賽多利斯。

1.3 糖酸鈉鹽的制備

以筆者所在實驗室已經(jīng)構(gòu)建的菌株K. pneumoniae-ΔbubA為生產(chǎn)菌株，采用5 L發(fā)酵罐，以兩段法發(fā)酵制備2-酮基葡萄糖酸[26]。在第1階段，攪拌槳轉(zhuǎn)速為500 r/min，發(fā)酵溫度為37.0 ℃，通氣量為0.8 N·m3/h，用30%質(zhì)量分數(shù)的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值為7.00。待菌體生長到D600 nm約為6.0時，進入第2階段的發(fā)酵，將攪拌槳轉(zhuǎn)速提升為800 r/min，控制發(fā)酵液的pH值為5.00。在發(fā)酵過程中通過高效液相色譜及時檢測底物葡萄糖的質(zhì)量濃度，當(dāng)其質(zhì)量濃度為20～30 g/L時，補加底物葡萄糖。

2-酮基葡萄糖酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：100 g/L 葡萄糖，4 g/L玉米漿，5 g/L硫酸銨，5 g/L酵母提取物，5 g/L氯化鈣，3 g/L三水合乙酸鈉，04 g/L氯化鉀，0.1 g/L七水硫酸鎂，0.02 g/L七水硫酸亞鐵，0.01 g/L一水合硫酸錳。

從發(fā)酵液中提取2-酮基葡萄糖酸鈉，按照圖2的流程進行分離提純以獲取純度較高的2-酮基葡萄糖酸鈉晶體。以木糖為底物替代葡萄糖，采用與2-酮基葡萄糖酸鈉相同的方法制備木糖酸鈉。

1.4 糖酸根與鈣、鎂離子配合物穩(wěn)定常數(shù)的測定

配制CaCl2濃度梯度為5.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-3、5.0×10-4、2.0×10-5 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別向其中滴加1～2滴飽和硝酸鉀溶液以維持溶液的離子強度，用離子電極測得pX2+（X2+表示二價陽離子），根據(jù)相應(yīng)的pX2+繪制鈣離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，用相同的方法繪制鎂離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。在250 mL錐形瓶中加入5 mL濃度為0.1 mol/L的CaCl2溶液，然后向其中加入45 mL去離子水，振蕩混勻。用50 mL滴定管向混合溶液中滴加0.1 mol/L葡萄糖酸鈉溶液，用電極測定并記錄溶液的pX2+變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中的游離鈣離子濃度。2-酮基葡萄糖酸根、木糖酸根與鈣離子、鎂離子結(jié)合的研究方法同上。

根據(jù)Nelson等的報道[27-28]，使糖酸根與鈣離子按1 ∶ 1結(jié)合形成配合物，鈣離子與糖酸根形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)K的計算公式：

鎂離子與糖酸根按照1 ∶ 1的物質(zhì)的量之比結(jié)合，其平衡常數(shù)K的計算表達式同式（1）。

1.5 用糖酸鈉溶液溶解磷酸鈣和磷酸鎂

準(zhǔn)確稱取于105.0 ℃干燥3 h的磷酸鈣固體粉末 0.50 g、葡萄糖酸鈉固體1.50 g（4.84 mmol），用去離子水溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容，再將溶液轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，用橡膠塞封口，配制成葡萄糖酸根與總鈣物質(zhì)的量之比為1 ∶ 1的體系。用同樣方法配制葡萄糖酸根與總鈣物質(zhì)的量比分別為0 ∶ 1、2 ∶ 1、4 ∶ 1、6 ∶ 1、8 ∶ 1、10 ∶ 1的體系。于25.0 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行溶解，每天取樣，將樣品于10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，采用鉬藍比色法測定濾液中的磷酸根含量[29]。用2-酮基葡萄糖酸鈉和木糖酸鈉溶液溶解磷酸鈣以及用糖酸鈉溶液溶解磷酸鎂采用與上述相同的方法。

1.6 用糖酸鈉溶液溶解土壤中的磷元素

（1）土壤中有效磷濃度的測定。稱取10.00 g風(fēng)干土壤于50 mL離心管中，然后加入30 mL水，蓋緊蓋子，漩渦振蕩1～2 min，靜置30 min，用5 mol/L NaHCO3溶液浸提土壤中的有效磷并測定其有效磷濃度[30]。（2）土壤中總磷濃度的測定。土壤中含磷礦物質(zhì)和有機磷化合物在高溫下與高氯酸作用，全部轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽。采用鉬藍比色法測定其中的磷酸根濃度，即土壤中的總磷濃度。稱取1.00 g土壤樣品置于消解管中，加入少量水潤濕，再加入 8 mL 濃硫酸過夜浸泡處理;然后向其中加入 0.5 mL 高氯酸，用紅外消解爐于120 ℃消解 120 min 后靜置至室溫，向其中多次少量加入去離子水，并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶內(nèi)，振蕩混勻，待其冷卻至室溫后再定容。采用鉬藍比色法測定所得溶液中的磷酸根濃度，即為土壤樣品中的全磷濃度[31]。（3）糖酸解磷試驗。分別稱取6份土壤樣品于燒杯中，每份10.00 g，加入0.05 mol/L葡萄糖酸鈉溶液，使溶液總體積為100 mL，得到的葡萄糖酸鈉溶液終濃度分別為1×10-3、2×10-3、4×10-3、6×10-3、8×10-3、1×10-2 mol/L，在25 ℃、200 r/min 條件下振蕩，每天取樣并測定溶液中的磷酸根濃度。用2-酮基葡萄糖酸鈉和木糖酸鈉溶解土壤中難溶性磷酸鹽的方法與用葡萄糖酸鈉溶解土壤中難溶性磷酸鹽的方法相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖酸鈉鹽的制備以及分離純化

按照“1.3”節(jié)中的操作步驟，利用葡萄糖制備 2-酮基葡萄糖酸鈉。經(jīng)過42 h的發(fā)酵，底物葡萄糖完全被消耗，發(fā)酵液中產(chǎn)生了166.0 g/L 2-酮基葡萄糖酸鈉，底物轉(zhuǎn)化率為0.91 g/g。

以木糖為底物時，經(jīng)過120 h的發(fā)酵，產(chǎn)生的木糖酸鈉質(zhì)量濃度為207.8 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為 0.82 g/g。將發(fā)酵液按照圖2中糖酸鈉分離提純的步驟進行分離純化，根據(jù)液相檢測結(jié)果，每步收集的糖酸鈉質(zhì)量和回收率見表1。2-酮基葡萄糖酸鈉在脫色步驟中損失較多，回收率為93.2%;其他步驟中產(chǎn)品的回收率都較高，重結(jié)晶后晶體的純度為98.9%。此外，木糖酸鈉脫色后的回收率為934%，重結(jié)晶后晶體的純度為99.0%。

2.2 基于離子電極法測定鈣離子和鎂離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用離子電極法測得鈣離子和鎂離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液;測得的pX2+與對應(yīng)離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，其中鈣離子濃度（y1）與pX2+（x1）之間的關(guān)系式：y1=-0.011 2x1+0.098 4，r2=0.997 2;鎂離子濃度（y2）與pX2+（x2）之間的關(guān)系式：y2=-0.011 3x2+0070 4，r2=0.998 7。

2.3 糖酸根與鈣離子、鎂離子的結(jié)合及其穩(wěn)定常數(shù)的測定

按照“1.4節(jié)”中所列方法，向氯化鈣、氯化鎂溶液中滴加糖酸鈉溶液，用離子電極測定離子濃度（圖4-a、圖4-b）。根據(jù)式（1），計算得到糖酸根與鈣離子、鎂離子形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)。

由圖4-c可知，鈣離子與葡萄糖酸根形成的配合物的穩(wěn)定平衡常數(shù)為58.8～79.7 L/mol，平均為66.1 L/mol;鈣離子與2-酮基葡萄糖酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為93.6～129.8 L/mol，平均為 109.7 L/mol;鈣離子與木糖酸根結(jié)合的平衡常數(shù)為12.7～31.3 L/mol，平均為19.2 L/mol?？傮w看出，糖酸根與鈣離子形成的配合物的穩(wěn)定性排序如下：2-酮基葡萄糖酸>葡萄糖酸>木糖酸。

由圖4-d可知，鎂離子與葡萄糖酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為88.0～121.0 L/mol，平均為 106.3 L/mol;鎂離子與2-酮基葡萄糖酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為116.3～187.5 L/mol，平均為161.2 L/mol;鎂離子與木糖酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為17.9～29.4 L/mol，平均為23.8 L/mol?？傮w看出，糖酸根與鎂離子形成的配合物穩(wěn)定性排序如下：2-酮基葡萄糖酸>葡萄糖酸>木糖酸。

2.4 乙酸鈉和乳酸鈉溶解磷酸鈣和磷酸鎂

為了對比其他小分子有機酸化合物的溶磷效果，本試驗測定了乙酸鈉和乳酸鈉與鈣離子、鎂離子形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)，測定方法與糖酸試驗相同。由圖5-a可以看出，鈣離子與乙酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為0.1～4.1 L/mol，平均為 1.1 L/mol;乳酸根與鈣離子形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為0.1～7.6 L/mol，平均為3.2 L/mol。由圖5-b可以看出，鎂離子與乙酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為0.3～4.7 L/mol，平均為1.4 L/mol;鎂離子與乳酸根形成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)為0.7～5.7 L/mol，平均為2.3 L/mol。從配合物的穩(wěn)定常數(shù)可以看出，乙酸根、乳酸根與鈣離子、鎂離子形成配合物的能力較弱，或不形成配合物。

2.5 糖酸鈉溶解磷酸鈣和磷酸鎂

按照“1.5”中所述方法，用不同濃度的糖酸鈉溶液溶解磷酸鈣和磷酸鎂。由圖6、圖7可以看出，與空白對照組相比，糖酸鈉溶液能夠有效促進磷酸鈣、磷酸鎂的溶解，并且在一定范圍內(nèi)隨著糖酸鈉濃度的增加，磷酸根濃度（以P2O5計，下同）也在增加。在0～4 d，混合溶液中的磷酸根濃度逐漸增大，在4～6 d時，磷酸鈣和磷酸鎂的溶解達到穩(wěn)定，溶液中的磷酸根濃度達到最大值。

當(dāng)糖酸濃度為4.84×10-1 mol/L時，即糖酸與總鈣的物質(zhì)的量之比為10 ∶ 1時，用葡萄糖酸鈉、2-酮葡萄糖酸鈉、木糖酸鈉溶液溶解磷酸鈣，溶液中的磷酸根質(zhì)量濃度分別為204.6、238.9、82.0 mg/L。用葡萄糖酸鈉、2-酮基葡萄糖酸鈉、木糖酸鈉溶液溶解磷酸鎂，溶液中的磷酸根質(zhì)量濃度分別為318.7、1 034.4、207.6 mg/L。這些都遠大于磷酸鈣、磷酸鎂在水溶液中的磷酸根質(zhì)量濃度（分別為14.4、18.3 mg/L）。此外，當(dāng)磷酸鈣和磷酸鎂的溶解達到穩(wěn)定時，用電極測定溶液中的鈣、鎂離子濃度，計算得到此時溶液中的磷酸根濃度，結(jié)果顯示，該計算所得磷酸根濃度與實際測得溶液中的磷酸根濃度誤差在20%范圍內(nèi)。

2.6 糖酸溶解土壤中的磷元素

土壤樣品呈弱堿性，其pH值為8.08，有效磷含量為12.1 mg/kg，總磷含量為712.2 mg/kg。用系列濃度梯度的糖酸鈉溶液溶解土壤中的磷，從圖8可以看出，10 d后土壤中的難溶性磷酸鹽的溶解達到平衡;空白對照組使用純水溶解，土壤中磷酸根的質(zhì)量濃度為0.6 mg/L;在試驗組中使用糖酸鈉后，土壤中的磷酸根質(zhì)量濃度均大于對照組;在利用1.0×10-2 mol/L糖酸鈉溶解磷酸鹽達到平衡時，葡萄糖酸鈉、2-酮基葡萄糖酸鈉、木糖酸鈉溶解的土壤中的磷酸根質(zhì)量濃度分別為1.3、1.4、1.0 mg/L，平均大約是對照土壤樣品的2倍。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同于乳酸、乙酸，葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸、木糖酸能與鈣離子、鎂離子形成穩(wěn)定的配合物，從而降低溶液中游離鈣、鎂離子質(zhì)量濃度。鈣、鎂離子質(zhì)量濃度的降低，使得磷酸鈣與磷酸鎂的溶解平衡發(fā)生移動，增加了溶液中磷酸根的質(zhì)量濃度，這是微生物解磷的一種重要機制。因此通過生物發(fā)酵法制備的糖酸類化合物，有望成為一種解磷劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中。

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