李亞嬌 孫國(guó)琴 郭九峰
關(guān)鍵詞:草原蘑菇;ITS序列;分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué);系統(tǒng)進(jìn)化樹;分化時(shí)間
系統(tǒng)發(fā)生(phylogeny)也稱系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)演化,是某一個(gè)類群的形成和發(fā)展過程,也就是進(jìn)化或演化關(guān)系[1-2]。草原蘑菇主要生長(zhǎng)在我國(guó)內(nèi)蒙古中部草原地區(qū),在草原上形成蘑菇圈,維持牧草與草原蘑菇共生的生態(tài)體系[3]。目前對(duì)草原蘑菇分類的研究一直處于形態(tài)學(xué)分類研究階段,運(yùn)用分子標(biāo)記對(duì)其屬內(nèi)種類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析的研究還是比較滯后的。國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究食用菌分類的報(bào)道[4-6]。武冬梅運(yùn)用分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)探究新疆野生羊肚菌在物種水平上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[7]。劉曉亮等通過分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)對(duì)東北大小興安嶺地區(qū)的紅菇屬進(jìn)行物種多樣性分析,共鑒定出23個(gè)紅菇屬物種,其中有3個(gè)種此前從未在我國(guó)報(bào)道過,分別是果香紅菇、暗紅紅菇和諾爾亞紅菇[8]。目前,利用草原蘑菇內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)探究還未見報(bào)道,本研究通過18S和ITS 2組通用引物擴(kuò)增草原蘑菇基因組DNA片段,產(chǎn)物直接測(cè)序,結(jié)合BLAST、MEGA 6.0等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)、遺傳參數(shù)計(jì)算,以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、分子鐘等[9-11],以期為草原蘑菇的鑒定、進(jìn)化分類及遺傳育種方面的深入研究提供數(shù)據(jù)參考。
核糖體DNA(rDNA)中既包含保守的編碼區(qū)18S、5.8S和28S,適合種以下水平的研究[12-13],又包含進(jìn)化速率較快的非編碼區(qū),內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和2(ITS1和ITS2)以及非轉(zhuǎn)錄區(qū),承受的進(jìn)化選擇壓力較小,進(jìn)化速度較快,適合屬以下水平的研究[14-15]。因此,常選用18S和ITS通用引物作分子標(biāo)記研究不同分類地位的物種間關(guān)系[16]。這在食用菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育中已有大量應(yīng)用[17],錢雪婷等基于ITS序列分析秦巴山區(qū)黑木耳菌株的遺傳多樣性,為今后秦巴山區(qū)黑木耳菌株的遺傳多樣性及優(yōu)良品種的遺傳育種奠定了理論基礎(chǔ)[18]。戴淑娟等對(duì)采自新加坡的多孔菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,該新種屬于變色臥孔菌屬分支的一個(gè)明確的支系[19]。劉麗娜等利用ITS序列分析一個(gè)子實(shí)體菌蓋為酒粉紅色的金針菇新變型,結(jié)果表明,該變型同一子實(shí)體具有5種不同的ITS序列,表明金針菇存在豐富的種內(nèi)遺傳多樣性[20]。本研究采用18S和ITS 2組通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),2組測(cè)序結(jié)果互相印證補(bǔ)充,可使結(jié)果更加可靠。
草原蘑菇是內(nèi)蒙古錫林郭勒草原產(chǎn)出的上品山珍,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,是珍稀的食藥用菌[21-22]。草原蘑菇主要品種有白蘑、黑蘑、香杏蘑、雞爪蘑、珍珠蘑等,被譽(yù)為“草原明珠”“口蘑之王”等[23]。草原蘑菇以草-牧-菌循環(huán)的獨(dú)特生長(zhǎng)方式維系著大草原的生態(tài)平衡。近年來,草原氣候干旱、退化日益嚴(yán)重,載畜量增加,加之人們過度采食,使這一珍貴的野生草原蘑菇自然生存條件愈加惡化,甚至瀕臨滅絕,其資源保育、馴化及利用研究任務(wù)艱巨,而且目前市場(chǎng)上的草原蘑菇種類混亂,以次充好、胡亂命名等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,令人真?zhèn)坞y辨[24]。本研究從本質(zhì)上對(duì)內(nèi)蒙古中部草原地區(qū)草原蘑菇品系進(jìn)行鑒定,通過形態(tài)學(xué)與分子標(biāo)記相結(jié)合,研究各菌株之間的親緣關(guān)系和分化時(shí)間,以期為后續(xù)草原蘑菇的種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用、草原蘑菇品種選育和遺傳改良提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試材料
草原白蘑和草原黑蘑采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒草原地區(qū),草原白蘑編號(hào)為草原白蘑74~89號(hào),包含蒙古口蘑、花臉香蘑、青腿子等;草原黑蘑編號(hào)為蒙白音1~73號(hào),其中,1~37號(hào)為白色鱗片,38~73號(hào)為棕色鱗片。
1.2 DNA提取
1.2.1 子實(shí)體DNA提取 將供試子實(shí)體置于 65 ℃ 烘箱內(nèi)8 h烘干,然后置于微量植物樣品粉碎機(jī)內(nèi)粉碎,分裝于離心管內(nèi),做好標(biāo)記以備DNA提取。稱取適量子實(shí)體粉末用天根試劑盒提取DNA[25]。
1.2.2 菌絲體DNA提取 提取適量菌絲體,置于液氮中研磨后用天根試劑盒提取DNA。
1.3 PCR擴(kuò)增
18S序列通用引物(18S上和18S下)堿基序列為18S上:GTAGTCATATGCTTGTCTC;18S下:TCCGCAGGTTCACCTACGGA。
ITS序列通用引物(ITS1和ITS4)堿基序列為ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。
PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系,包括Mix 10 μL,引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性40 s,45 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸10 min,4 ℃保存。電泳條件:1.2%瓊脂糖凝膠,電壓為100 V。
用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,檢測(cè)合格后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。
1.4 序列比對(duì)、序列的數(shù)據(jù)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析
將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì),根據(jù)比對(duì)序列結(jié)果及形態(tài)特征,確定食用菌名稱和相關(guān)菌種信息。選擇羊肚菌為外類群,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單一位點(diǎn)、簡(jiǎn)并態(tài)密碼子、CpG島、覆蓋率、種內(nèi)種間遺傳距離、分子鐘、鄰接(neighbor-joining method,簡(jiǎn)稱NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以自展法(Bootstrap 1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。
2 結(jié)果與分析
將采集到的草原蘑菇按照子實(shí)體顏色、大小、形狀等特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類[26],然后通過ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物,比較序列間的差異,來建立群體之間的親緣、進(jìn)化關(guān)系,從而從本質(zhì)上進(jìn)一步鑒定[27]。
2.1 形態(tài)描述
2.1.1 蒙白音系列 草原黑蘑別稱白鱗蘑菇,屬傘菌目蘑菇科蘑菇屬。蒙白音系列子實(shí)體為白色和棕色2類,菌蓋直徑為6~15 cm,半球形至平展,中部鱗片厚而大,龜裂明顯,有時(shí)留有菌幕殘片。菌裙初期為白色,漸變?yōu)榉奂t色至黑褐色。菌褶初期為肉色,密,離生,不等長(zhǎng),隨著子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育成熟變?yōu)楹稚梁诤稚?。菌柄?shí)心白色近圓柱形,菌柄長(zhǎng)5.0~7.5 cm,粗0.7~7.0 cm。孢子呈卵圓形、橢圓形至長(zhǎng)橢圓形,孢子印為黑色、表面光滑,孢子大小為(5~10) μm×(4~7) μm。
2.1.2 白蘑系列 蒙古口蘑屬傘菌目口蘑科口蘑屬或白麗傘屬,別稱白蘑、口蘑、珍珠菇、查干蘑等。子實(shí)體通體純白色,初期半球形至成熟期菌蓋平展呈傘形,成熟子實(shí)體菌蓋直徑為5~17 cm,菌肉厚硬為白色,初期菌蓋邊緣內(nèi)卷;菌褶白色,稠密,彎生,不等長(zhǎng);菌柄粗壯,白色內(nèi)實(shí),長(zhǎng)3.5~7.0 cm,粗 1.5~4.6 cm,柄基部稍大。擔(dān)孢子呈腎形或橢圓形,孢子印為白色,表面光滑,孢子大小為(4~6) μm×(6~9) μm。
花臉香蘑屬傘菌目口蘑科香蘑屬,別稱白花臉。子實(shí)體菌蓋為白色,初期扁半球形至成熟期菌蓋平展邊緣上翹呈斗笠狀,邊緣水漬狀烏白色,成熟子實(shí)體菌蓋直徑為4.0~8.0 cm,菌肉較厚白色;菌褶白色,直生或彎生,稍稀,不等長(zhǎng);菌柄中粗,白色,長(zhǎng)3.5~7.0 cm,粗0.5~2.0 cm,內(nèi)實(shí),靠近基部常彎生。孢子呈橢圓形至近卵圓形,孢子印為白色,具粗糙麻點(diǎn),孢子大小為(3~5) μm×(6~10) μm。
青腿子屬傘菌目口蘑科香蘑屬。子實(shí)體菌蓋純白色,初期半球形至成熟期菌蓋平展邊緣上翹,成熟子實(shí)體菌蓋直徑為10~22 cm。菌肉較厚白色,初期邊緣內(nèi)卷;菌褶白色,稠密,彎生,不等長(zhǎng);菌柄中粗,白色,長(zhǎng)3.5~7.0 cm,粗0.8~3.0 cm,內(nèi)實(shí),基部稍大,柄由下向上青色光澤逐漸變深。孢子呈橢圓形至近卵圓形,孢子印為白色,具粗糙麻點(diǎn),孢子大小為(3~5) μm×(6~10) μm。
2.2 草原蘑菇序列分析
利用MEGA 6.0軟件統(tǒng)計(jì)89株草原蘑菇ITS基因序列,保守位點(diǎn)(conserve)數(shù)為275/544,變異位點(diǎn)(variable)數(shù)為268/544,簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsim-infor)數(shù)為180/544,單一位點(diǎn)(singleton)數(shù)為88/544,簡(jiǎn)并位點(diǎn)zore-fold為319/544、tow-fold為62/544、four-fold為40/544,CpG為30/544。89株草原蘑菇ITS序列G+C堿基含量分析結(jié)果見圖1,黑蘑G+C堿基平均含量為42.73%,白蘑G+C堿基平均含量為4114%,G+C的含量明顯低于A+T的含量,白蘑G+C的含量低于黑蘑G+C的含量。
2.3 遺傳距離、親緣關(guān)系及分化時(shí)間分析
ITS基因序列遺傳距離計(jì)算結(jié)果見表1,屬內(nèi)遺傳距離較小而屬間遺傳距離較大,黑蘑和白蘑種間遺傳距離為0~0.45,其中黑蘑種內(nèi)遺傳距離為0~0.05,白蘑種內(nèi)遺傳距離為0~0.24。說明黑蘑之間進(jìn)化距離較近,白蘑之間進(jìn)化種類具有多樣性(其中沒有標(biāo)出的編號(hào)遺傳距離均為0)。
以測(cè)得ITS序列為依據(jù),采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,用羊肚菌(KX809733)作為外類群(圖2),并用最大似然估計(jì)(maximum likelihood)法驗(yàn)證分類結(jié)果的準(zhǔn)確性,結(jié)果表明,2種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹關(guān)系基本一致,89株草原蘑菇可分為3組,A組為黑蘑,B、C組為白蘑,白蘑遺傳多樣性較豐富,黑蘑則相對(duì)較少,34號(hào)與1~73號(hào)(除34號(hào)外)有相對(duì)差異外,其他基本相同,與遺傳距離矩陣相符。
利用ITS基因序列,計(jì)算草原蘑菇之間的分化時(shí)間。結(jié)果(圖3)表明,黑蘑和白蘑的分化時(shí)間為11萬年前,其中黑蘑中34號(hào)與其他黑蘑分化時(shí)間為3萬年前,白蘑中B類群和C類群分化時(shí)間為1萬年前。不同屬內(nèi)草原蘑菇分化時(shí)間較長(zhǎng),同一屬內(nèi)的草原蘑菇之間分化時(shí)間較小。
3 結(jié)論
ITS序列己被廣泛應(yīng)用于食用菌的科、屬級(jí)水平類群的親緣關(guān)系系統(tǒng)發(fā)育分析[28-29]。本研究將形態(tài)學(xué)分類與ITS序列相結(jié)合,用于內(nèi)蒙古中部地區(qū)的89株草原蘑菇親緣關(guān)系研究,發(fā)現(xiàn)屬內(nèi)遺傳距離較小親緣關(guān)系較近,而屬間遺傳距離較大。通過計(jì)算分化時(shí)間,白蘑和黑蘑分化于11萬年前,其中34號(hào)黑蘑與其他黑蘑分化于3萬年前,白蘑中B組與C組于1萬年前分化。采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,用最大似然估計(jì)法驗(yàn)證分類結(jié)果,最終2種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹關(guān)系基本一致。從構(gòu)建的進(jìn)化樹可以看出,89株草原蘑菇可分為3組,黑蘑為1組,黑蘑遺傳較穩(wěn)定,白蘑分為2組,白蘑的遺傳多樣性較豐富,很有可能是由于當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件引起的,如干旱、紫外線過強(qiáng)、晝夜溫差過大導(dǎo)致變異。針對(duì)草原白蘑的遺傳多樣性狀況,可以認(rèn)為內(nèi)蒙古中部地區(qū)草原白蘑具有較高的進(jìn)化潛力和適應(yīng)能力。內(nèi)蒙古屬干旱、半干旱地區(qū),常年干旱少雨,近些年尤為嚴(yán)重,加之濫采濫挖造成野生草原蘑菇瀕臨滅絕,本研究在物種多樣性的研究基礎(chǔ)上結(jié)合ITS片段分析,對(duì)野生草原蘑菇的資源保護(hù)及如何利用分類結(jié)果進(jìn)行人工馴化栽培具有指導(dǎo)意義。
草原蘑菇具有一定的遺傳多樣性,當(dāng)?shù)啬撩穸嘁孕螒B(tài)學(xué)來定義其種類,即外觀層面,則造成定義混亂,存在一定的偏差,因此,僅依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)特征來進(jìn)行草原蘑菇的分類方法受到了越來越大的挑戰(zhàn),不能得到分子數(shù)據(jù)的支持。通過基于ITS分子層面測(cè)序,發(fā)現(xiàn)至少存在3個(gè)屬,具有屬間多態(tài)性,那么若要具體到種間分類將更加混亂,所以還需要新的分子標(biāo)記方法進(jìn)行進(jìn)一步的分類、探索,充分地挖掘草原蘑菇資源。
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