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    內(nèi)蒙古錫林郭勒草原主要野生蘑菇分子進化及其系統(tǒng)發(fā)生學(xué)

    2020-06-21 15:35:06李亞嬌孫國琴郭九峰
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年9期

    李亞嬌 孫國琴 郭九峰

    關(guān)鍵詞:草原蘑菇;ITS序列;分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué);系統(tǒng)進化樹;分化時間

    系統(tǒng)發(fā)生(phylogeny)也稱系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)演化,是某一個類群的形成和發(fā)展過程,也就是進化或演化關(guān)系[1-2]。草原蘑菇主要生長在我國內(nèi)蒙古中部草原地區(qū),在草原上形成蘑菇圈,維持牧草與草原蘑菇共生的生態(tài)體系[3]。目前對草原蘑菇分類的研究一直處于形態(tài)學(xué)分類研究階段,運用分子標記對其屬內(nèi)種類進行系統(tǒng)發(fā)生分析的研究還是比較滯后的。國內(nèi)外有大量關(guān)于運用系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究食用菌分類的報道[4-6]。武冬梅運用分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)探究新疆野生羊肚菌在物種水平上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[7]。劉曉亮等通過分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)對東北大小興安嶺地區(qū)的紅菇屬進行物種多樣性分析,共鑒定出23個紅菇屬物種,其中有3個種此前從未在我國報道過,分別是果香紅菇、暗紅紅菇和諾爾亞紅菇[8]。目前,利用草原蘑菇內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)探究還未見報道,本研究通過18S和ITS 2組通用引物擴增草原蘑菇基因組DNA片段,產(chǎn)物直接測序,結(jié)合BLAST、MEGA 6.0等生物信息學(xué)軟件進行序列比對、遺傳參數(shù)計算,以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹、分子鐘等[9-11],以期為草原蘑菇的鑒定、進化分類及遺傳育種方面的深入研究提供數(shù)據(jù)參考。

    核糖體DNA(rDNA)中既包含保守的編碼區(qū)18S、5.8S和28S,適合種以下水平的研究[12-13],又包含進化速率較快的非編碼區(qū),內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和2(ITS1和ITS2)以及非轉(zhuǎn)錄區(qū),承受的進化選擇壓力較小,進化速度較快,適合屬以下水平的研究[14-15]。因此,常選用18S和ITS通用引物作分子標記研究不同分類地位的物種間關(guān)系[16]。這在食用菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育中已有大量應(yīng)用[17],錢雪婷等基于ITS序列分析秦巴山區(qū)黑木耳菌株的遺傳多樣性,為今后秦巴山區(qū)黑木耳菌株的遺傳多樣性及優(yōu)良品種的遺傳育種奠定了理論基礎(chǔ)[18]。戴淑娟等對采自新加坡的多孔菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,該新種屬于變色臥孔菌屬分支的一個明確的支系[19]。劉麗娜等利用ITS序列分析一個子實體菌蓋為酒粉紅色的金針菇新變型,結(jié)果表明,該變型同一子實體具有5種不同的ITS序列,表明金針菇存在豐富的種內(nèi)遺傳多樣性[20]。本研究采用18S和ITS 2組通用引物擴增產(chǎn)物直接測序,對測序結(jié)果進行比對,2組測序結(jié)果互相印證補充,可使結(jié)果更加可靠。

    草原蘑菇是內(nèi)蒙古錫林郭勒草原產(chǎn)出的上品山珍,具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值,是珍稀的食藥用菌[21-22]。草原蘑菇主要品種有白蘑、黑蘑、香杏蘑、雞爪蘑、珍珠蘑等,被譽為“草原明珠”“口蘑之王”等[23]。草原蘑菇以草-牧-菌循環(huán)的獨特生長方式維系著大草原的生態(tài)平衡。近年來,草原氣候干旱、退化日益嚴重,載畜量增加,加之人們過度采食,使這一珍貴的野生草原蘑菇自然生存條件愈加惡化,甚至瀕臨滅絕,其資源保育、馴化及利用研究任務(wù)艱巨,而且目前市場上的草原蘑菇種類混亂,以次充好、胡亂命名等現(xiàn)象時有發(fā)生,令人真?zhèn)坞y辨[24]。本研究從本質(zhì)上對內(nèi)蒙古中部草原地區(qū)草原蘑菇品系進行鑒定,通過形態(tài)學(xué)與分子標記相結(jié)合,研究各菌株之間的親緣關(guān)系和分化時間,以期為后續(xù)草原蘑菇的種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用、草原蘑菇品種選育和遺傳改良提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    草原白蘑和草原黑蘑采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒草原地區(qū),草原白蘑編號為草原白蘑74~89號,包含蒙古口蘑、花臉香蘑、青腿子等;草原黑蘑編號為蒙白音1~73號,其中,1~37號為白色鱗片,38~73號為棕色鱗片。

    1.2 DNA提取

    1.2.1 子實體DNA提取 將供試子實體置于 65 ℃ 烘箱內(nèi)8 h烘干,然后置于微量植物樣品粉碎機內(nèi)粉碎,分裝于離心管內(nèi),做好標記以備DNA提取。稱取適量子實體粉末用天根試劑盒提取DNA[25]。

    1.2.2 菌絲體DNA提取 提取適量菌絲體,置于液氮中研磨后用天根試劑盒提取DNA。

    1.3 PCR擴增

    18S序列通用引物(18S上和18S下)堿基序列為18S上:GTAGTCATATGCTTGTCTC;18S下:TCCGCAGGTTCACCTACGGA。

    ITS序列通用引物(ITS1和ITS4)堿基序列為ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。

    PCR擴增采用20 μL反應(yīng)體系,包括Mix 10 μL,引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性40 s,45 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸10 min,4 ℃保存。電泳條件:1.2%瓊脂糖凝膠,電壓為100 V。

    用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,檢測合格后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

    1.4 序列比對、序列的數(shù)據(jù)分析及系統(tǒng)進化分析

    將測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對,根據(jù)比對序列結(jié)果及形態(tài)特征,確定食用菌名稱和相關(guān)菌種信息。選擇羊肚菌為外類群,進行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MEGA 6.0軟件進行保守位點、變異位點、簡約信息位點、單一位點、簡并態(tài)密碼子、CpG島、覆蓋率、種內(nèi)種間遺傳距離、分子鐘、鄰接(neighbor-joining method,簡稱NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以自展法(Bootstrap 1 000次重復(fù))檢驗各分支的置信度。

    2 結(jié)果與分析

    將采集到的草原蘑菇按照子實體顏色、大小、形狀等特征進行形態(tài)學(xué)分類[26],然后通過ITS序列擴增產(chǎn)物,比較序列間的差異,來建立群體之間的親緣、進化關(guān)系,從而從本質(zhì)上進一步鑒定[27]。

    2.1 形態(tài)描述

    2.1.1 蒙白音系列 草原黑蘑別稱白鱗蘑菇,屬傘菌目蘑菇科蘑菇屬。蒙白音系列子實體為白色和棕色2類,菌蓋直徑為6~15 cm,半球形至平展,中部鱗片厚而大,龜裂明顯,有時留有菌幕殘片。菌裙初期為白色,漸變?yōu)榉奂t色至黑褐色。菌褶初期為肉色,密,離生,不等長,隨著子實體生長發(fā)育成熟變?yōu)楹稚梁诤稚?。菌柄實心白色近圓柱形,菌柄長5.0~7.5 cm,粗0.7~7.0 cm。孢子呈卵圓形、橢圓形至長橢圓形,孢子印為黑色、表面光滑,孢子大小為(5~10) μm×(4~7) μm。

    2.1.2 白蘑系列 蒙古口蘑屬傘菌目口蘑科口蘑屬或白麗傘屬,別稱白蘑、口蘑、珍珠菇、查干蘑等。子實體通體純白色,初期半球形至成熟期菌蓋平展呈傘形,成熟子實體菌蓋直徑為5~17 cm,菌肉厚硬為白色,初期菌蓋邊緣內(nèi)卷;菌褶白色,稠密,彎生,不等長;菌柄粗壯,白色內(nèi)實,長3.5~7.0 cm,粗 1.5~4.6 cm,柄基部稍大。擔孢子呈腎形或橢圓形,孢子印為白色,表面光滑,孢子大小為(4~6) μm×(6~9) μm。

    花臉香蘑屬傘菌目口蘑科香蘑屬,別稱白花臉。子實體菌蓋為白色,初期扁半球形至成熟期菌蓋平展邊緣上翹呈斗笠狀,邊緣水漬狀烏白色,成熟子實體菌蓋直徑為4.0~8.0 cm,菌肉較厚白色;菌褶白色,直生或彎生,稍稀,不等長;菌柄中粗,白色,長3.5~7.0 cm,粗0.5~2.0 cm,內(nèi)實,靠近基部常彎生。孢子呈橢圓形至近卵圓形,孢子印為白色,具粗糙麻點,孢子大小為(3~5) μm×(6~10) μm。

    青腿子屬傘菌目口蘑科香蘑屬。子實體菌蓋純白色,初期半球形至成熟期菌蓋平展邊緣上翹,成熟子實體菌蓋直徑為10~22 cm。菌肉較厚白色,初期邊緣內(nèi)卷;菌褶白色,稠密,彎生,不等長;菌柄中粗,白色,長3.5~7.0 cm,粗0.8~3.0 cm,內(nèi)實,基部稍大,柄由下向上青色光澤逐漸變深。孢子呈橢圓形至近卵圓形,孢子印為白色,具粗糙麻點,孢子大小為(3~5) μm×(6~10) μm。

    2.2 草原蘑菇序列分析

    利用MEGA 6.0軟件統(tǒng)計89株草原蘑菇ITS基因序列,保守位點(conserve)數(shù)為275/544,變異位點(variable)數(shù)為268/544,簡約信息位點(parsim-infor)數(shù)為180/544,單一位點(singleton)數(shù)為88/544,簡并位點zore-fold為319/544、tow-fold為62/544、four-fold為40/544,CpG為30/544。89株草原蘑菇ITS序列G+C堿基含量分析結(jié)果見圖1,黑蘑G+C堿基平均含量為42.73%,白蘑G+C堿基平均含量為4114%,G+C的含量明顯低于A+T的含量,白蘑G+C的含量低于黑蘑G+C的含量。

    2.3 遺傳距離、親緣關(guān)系及分化時間分析

    ITS基因序列遺傳距離計算結(jié)果見表1,屬內(nèi)遺傳距離較小而屬間遺傳距離較大,黑蘑和白蘑種間遺傳距離為0~0.45,其中黑蘑種內(nèi)遺傳距離為0~0.05,白蘑種內(nèi)遺傳距離為0~0.24。說明黑蘑之間進化距離較近,白蘑之間進化種類具有多樣性(其中沒有標出的編號遺傳距離均為0)。

    以測得ITS序列為依據(jù),采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,用羊肚菌(KX809733)作為外類群(圖2),并用最大似然估計(maximum likelihood)法驗證分類結(jié)果的準確性,結(jié)果表明,2種方法構(gòu)建的進化樹關(guān)系基本一致,89株草原蘑菇可分為3組,A組為黑蘑,B、C組為白蘑,白蘑遺傳多樣性較豐富,黑蘑則相對較少,34號與1~73號(除34號外)有相對差異外,其他基本相同,與遺傳距離矩陣相符。

    利用ITS基因序列,計算草原蘑菇之間的分化時間。結(jié)果(圖3)表明,黑蘑和白蘑的分化時間為11萬年前,其中黑蘑中34號與其他黑蘑分化時間為3萬年前,白蘑中B類群和C類群分化時間為1萬年前。不同屬內(nèi)草原蘑菇分化時間較長,同一屬內(nèi)的草原蘑菇之間分化時間較小。

    3 結(jié)論

    ITS序列己被廣泛應(yīng)用于食用菌的科、屬級水平類群的親緣關(guān)系系統(tǒng)發(fā)育分析[28-29]。本研究將形態(tài)學(xué)分類與ITS序列相結(jié)合,用于內(nèi)蒙古中部地區(qū)的89株草原蘑菇親緣關(guān)系研究,發(fā)現(xiàn)屬內(nèi)遺傳距離較小親緣關(guān)系較近,而屬間遺傳距離較大。通過計算分化時間,白蘑和黑蘑分化于11萬年前,其中34號黑蘑與其他黑蘑分化于3萬年前,白蘑中B組與C組于1萬年前分化。采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,用最大似然估計法驗證分類結(jié)果,最終2種方法構(gòu)建的進化樹關(guān)系基本一致。從構(gòu)建的進化樹可以看出,89株草原蘑菇可分為3組,黑蘑為1組,黑蘑遺傳較穩(wěn)定,白蘑分為2組,白蘑的遺傳多樣性較豐富,很有可能是由于當?shù)氐臍夂驐l件引起的,如干旱、紫外線過強、晝夜溫差過大導(dǎo)致變異。針對草原白蘑的遺傳多樣性狀況,可以認為內(nèi)蒙古中部地區(qū)草原白蘑具有較高的進化潛力和適應(yīng)能力。內(nèi)蒙古屬干旱、半干旱地區(qū),常年干旱少雨,近些年尤為嚴重,加之濫采濫挖造成野生草原蘑菇瀕臨滅絕,本研究在物種多樣性的研究基礎(chǔ)上結(jié)合ITS片段分析,對野生草原蘑菇的資源保護及如何利用分類結(jié)果進行人工馴化栽培具有指導(dǎo)意義。

    草原蘑菇具有一定的遺傳多樣性,當?shù)啬撩穸嘁孕螒B(tài)學(xué)來定義其種類,即外觀層面,則造成定義混亂,存在一定的偏差,因此,僅依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)特征來進行草原蘑菇的分類方法受到了越來越大的挑戰(zhàn),不能得到分子數(shù)據(jù)的支持。通過基于ITS分子層面測序,發(fā)現(xiàn)至少存在3個屬,具有屬間多態(tài)性,那么若要具體到種間分類將更加混亂,所以還需要新的分子標記方法進行進一步的分類、探索,充分地挖掘草原蘑菇資源。

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