辣椒胞質(zhì)雄性不育系CaNAD9線粒體基因的克隆及表達分析

楊婷玉 邵貴芳 張水 王姣 張靖柔 趙凱 鄧明華

摘? 要：為了深入研究辣椒胞質(zhì)雄性不育與能量代謝之間的關(guān)系，本研究以辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A和同型保持系9704B為實驗材料，克隆了線粒體基因組CaNAD9基因，比較了其一級結(jié)構(gòu)在2種材料間的差異，利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在保持系9704B不同組織中的表達模式，以及胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B花蕾不同發(fā)育時期的表達差異。結(jié)果表明：通過對雙向測序進行分析，辣椒CaNAD9基因CDS長度為573 bp;生物信息學分析表明CaNAD9基因編碼190個氨基酸殘基;CaNAD9基因轉(zhuǎn)錄本在不育系和保持系中均未發(fā)生RNA編輯;辣椒CaNAD9基因在不同組織中的表達量存在差異，且差異較為明顯，其中在種子中的表達量最高，在胎座中的表達量最低;辣椒CaNAD9基因的表達量在胞質(zhì)雄性不育系與保持系花蕾不同發(fā)育階段中存在一定差異，在花粉母細胞減數(shù)分裂期辣椒胞質(zhì)雄性不育系與同型保持系中的表達差異最為顯著。這種差異可能會使雄性不育系的能量代謝出現(xiàn)異常，從而導致辣椒雄性不育。

關(guān)鍵詞：辣椒;CaNAD9;胞質(zhì)雄性不育;能量代謝;基因表達

中圖分類號：S188? ? ? 文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Mitochondrial Gene of Cytoplasmic Male Sterile Line CaNAD9 in Pepper （Capsicum annuum L.）

YANG Tingyu， SHAO Guifang， ZHANG Shui， WANG Jiao， ZHANG Jingrou， ZHAO Kai，

DENG Minghua*

College of Horticulture and Landscape， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： In order to further study the relationship between the cytoplasmic male sterility and energy metabolism in pepper， the cytoplasmic male sterile line 9704A and homologous maintainer line 9704B were used as the experimental materials to clone the mitochondrial genome CaNAD9 gene and compare its primary structure. The difference between the two materials was analyzed by real-time quantitative PCR to analyze the expression pattern of the gene in different tissues of the maintainer line 9704B and the expression differences of the buds of the cytoplasmic male sterile line 9704A and the homologous maintainer line 9704B. The CDS length of the CaNAD9 consisted of 573 bp， which encoding 190 amino acids. RNA editing of the CaNAD9 transcript did not happened in both 9704A and 9704B. The expression of CaNAD9 in pepper was different in different tissues with the highest expression in seeds and the lowest in fetuses. There were some differences in different developmental stages of the flower buds， and the difference in the expression of the cytoplasmic male sterile lines and the homologous maintainers in the meiotic stage of pollen mother cells was the most significant. This difference may cause abnormalities in the energy metabolism of the male sterile line， leading to male sterility in the pepper.

Keywords： pepper （Capsicum annuum L.）; CaNAD9; cytoplasmic male sterility; energy metabolism; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.018

雄性不育是高等植物中普遍存在的一種自然現(xiàn)象。各種外界環(huán)境（光照、溫度、化學試劑）及其自身特性的影響，均可造成植物的雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常的功能性花粉，但雌性生殖器官正常發(fā)育[1]。目前植物的雄性不育來源比較廣泛，可借助各種人工手段來獲取雄性不育系，如天然的不育品種、自交、種間或種屬間雜交、理化誘導和T-DNA插入誘導、基因工程等[2]。根據(jù)Sears提出的“三型學說”理論，可將植物的雄性不育分為3類：（1）細胞核雄性不育。其不育主要由核基因控制并且遺傳方式遵循孟德爾遺傳定律。（2）細胞質(zhì)雄性不育。其不育主要由細胞器及細胞質(zhì)因子間的相互作用決定的，一般為母系遺傳，該類型不育系不能找到恢復系，在辣椒育種中沒有實際應(yīng)用價值。（3）細胞核質(zhì)互作不育。其不育主要由核不育基因和質(zhì)不育因子共同控制決定的[3]，又稱胞質(zhì)雄性不育。由于胞質(zhì)雄性不育植株在生產(chǎn)應(yīng)用上既可以篩選保持系，又可以獲得恢復系，所以在辣椒育種上，可以利用“三系配套”進行高效人工制種。本研究的實驗材料為向陽椒中發(fā)現(xiàn)并轉(zhuǎn)成穩(wěn)定不育系的8021A，以及21號牛角椒中發(fā)現(xiàn)并轉(zhuǎn)育的不育系9704A。實驗材料的不育系和不育度均高達100%，經(jīng)濟性狀優(yōu)良、抗性好、品質(zhì)優(yōu)、有較強的配合力和社會生產(chǎn)價值[4-5]。

在近年來的研究中，根據(jù)花粉敗育的不同方式和時期，可將胞質(zhì)雄性不育進行不同的劃分，可將胞質(zhì)雄性不育（CMS）分為孢子體雄性不育和配子體雄性不育，兩者都是在花粉發(fā)育的過程出現(xiàn)了異常[6]。研究發(fā)現(xiàn)，9704A的不育系屬于孢子體敗育型[7]。根據(jù)對細胞質(zhì)基因組以及胞質(zhì)雄性不育的研究結(jié)果表明，大多數(shù)植物中的胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）基因與線粒體有著密切的關(guān)系[8]。線粒體的主要功能是通過呼吸作用產(chǎn)生ATP。線粒體內(nèi)膜上存在一類電子傳遞體，為植物提供不同支路的脫氫酶和氧化酶，參與植物的光呼吸，輔酶因子和氨基酸的新陳代謝途徑[9]。細胞色素屬于含鐵的電子傳遞體。細胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）是植物生長發(fā)育過程中細胞正常死亡的一種方式。PCD發(fā)生異?？赡軐е轮参锏男坌圆挥?。細胞色素C的釋放不能導致PCD，但PCD的第一步就是ROS的爆發(fā)引起細胞色素C的釋放，從線粒體間隙進入到細胞質(zhì)中[10-11]。目前，電子傳遞鏈的干擾會導致雄性不育的假說已經(jīng)被證實，Shaya等[12]通過將截斷的線粒體基因（atp4、cox1、rps3）的cDNA片段進行克隆后轉(zhuǎn)入煙草植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入后的植株表現(xiàn)出雄性不育的表型。

NADH泛醌氧化還原酶N（也稱NADH脫氫酶）是線粒體電子傳遞過程中的第一個質(zhì)子泵，主要通過電子轉(zhuǎn)移驅(qū)動質(zhì)子的移動，使質(zhì)子由基質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外，展開生物氧化的第一步。基因NAD9（也就是線粒體NADH脫氫酶亞基9）在大蔥不育系和保持系中的擴增片段存在差異，NAD9基因在不育系的表達量均高于保持系[13]。

本研究以辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A和同型保持系9704B為實驗材料，克隆兩系線粒體編碼基因CaNAD9，研究其在兩系之間生物信息學和時空表達差異，以期為進一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選取湖南省蔬菜研究所選育的辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A（不育率高達100%）和同型保持系9704B為實驗材料。材料種植于云南農(nóng)業(yè)大學后山園林園藝學院蔬菜實驗基地。2個品種均于2018年1月上旬播種，2018年4月下旬定植，定植之后進行生長期常規(guī)管理。

待辣椒進入盛花盛果時期，取實驗材料。（1）在盛花期取胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B花蕾發(fā)育4個不同時期（造孢細胞增殖期、花粉母細胞減數(shù)分裂期、小孢子單核靠邊期、小孢子成熟期）作為研究兩系表達譜差異的材料;（2）在盛果期取同型保持系9704B植株的莖、葉、花、果皮、胎座、種子6個不同組織作為組織表達材料。所取材料均應(yīng)立刻用液氮處理后?80 ℃超低溫保存，用于DNA和RNA的提取。

1.2? 方法

1.2.1? DNA、RNA的提取及cDNA合成? DNA的提取采用BioTeKe公司的試劑盒進行提取，提取步驟參考試劑盒說明;利用Trizol試劑提取不同組織及花蕾不同發(fā)育階段的RNA，提取步驟參考試劑盒說明;DNA、RNA提取完畢后利用紫外分光光度計測定其濃度和純度;檢測合格后用TaKaRa試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;DNA，RNA在?80 ℃保存，cDNA在?20 ℃中保存，以用于后續(xù)的實驗。

1.2.2? 基因克隆? 根據(jù)GenBank中的目的基因序列（登錄號：NC_030100）設(shè)計特異性引物擴增其CDS全長編碼序列。用Primer 5.0設(shè)計特異性引物F1（5-GGCGA TTTCCGACAAGTCT-3）和R1（5-CCGACG ATCA AG A CAATTCC-3），DNA和RNA使用相同的引物。以DNA為模板的PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL;MiX 22 μL;上游引物1 μL;下游引物1 μL;Total 25 μL。反應(yīng)條件：98 ℃，2 min;98 ℃，10 s;58 ℃，15 s，35個循環(huán);72 ℃，10 s;72 ℃，5 min;4 ℃保存。以cDNA為模板的PCR反應(yīng)體系：cDNA（25 ng/L）0.5 μL;Premix 10 μL;上游引物0.4 μL;下游引物0.4 μL;無菌水8.7 μL;Total 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，2 min;94 ℃，30 s;55 ℃，30 s，39個循環(huán);72 ℃，10 s;72 ℃，5 min;4 ℃保存。

1.2.3? 生物信息學分析? 利用NCBI（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov）服務(wù)器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool（CDART）工具（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）獲取蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域;利用GenScan（http：//genes.mit.edu/ GENSCAN.html）預測cDNA序列;通過Compute pI/Mw Tool（http：//us.expasy.org/tools/pi_tool.html）預測氨基酸的分子量（Mw）和等電點（pI）;利用SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/）預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);使用DNAStar、BioEdit、ClustalX、MEGA 4和DNAMAN軟件進行核苷酸序列及氨基酸序列的比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4? 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）? 實時定量PCR采用TaKaRa公司SYBR? Premix Ex Taq TMII（Code No. RR820A）熒光定量試劑盒。在Applied Biosystem熒光定量PCR儀上進行，本研究采用20 μL反應(yīng)體系，各引物退火溫度均為60 ℃，每個樣品設(shè)3次重復?？瞻讓φ詹捎胐dH2O代替cDNA，其他試劑不變，qRT-PCR反應(yīng)體系如下：20 μL體系，10 μL SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ（購于TaKaRa公司），10 ?mol/L的上下游引物各0.8 μL，2 μL cDNA模板，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，6 μL ddH2O;實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40次。以ACTIN基因F2（5-TGCA GGAATCCACGAGACTAC-3）和R2（5-TAC CA CCACTGAGCACAATGTT-3）為陽性內(nèi)對照基因，校正cDNA模板的細胞拷貝數(shù)，根據(jù)NAD9基因的測序結(jié)果設(shè)計熒光定量特異性引物F3（5-GGGTCAAAAAAATGGAAAGA-3）和R3（5-AG G GATAATCAACTCCGCAA-3）。計算相對表達量采用2?CT方法計算相對表達量[14]。基因相對表達量圖表的坐標軸使用對數(shù)刻度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 辣椒CaNAD9基因的生物信息學分析

分別以辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B的cDNA為模板，采用特異性引物對進行CaNAD9基因進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步檢測結(jié)果表明目的片段與預期結(jié)果相符（圖1）。

以cDNA為模板的PCR擴增產(chǎn)物的雙向測序結(jié)果表明，擴增片段長度為762個堿基，進一步分析表明，該片段包含一個完整開放閱讀框（ORF）長度為573 bp，編碼由190個氨基酸殘基組成的肽鏈（蛋白質(zhì)）。分析發(fā)現(xiàn)，CaNAD9在不育系和保持系之間的擴增序列完全一致。CaNAD9蛋白編碼190個氨基酸殘基（圖2），CaNAD9蛋白質(zhì)等電點為6.763，分子量為22 637.57 Da，無信號肽，該蛋白位于細胞質(zhì)的概率是39.1%。以DNA為模板的PCR擴增產(chǎn)物雙向測序結(jié)果表明，擴增片段長度為762 bp左右，進一步分析表明：該片段包含一個完整開放閱讀框（ORF），該ORF在保持系和不育中的片段序列完全一致，長度為573 bp，不存在任何堿基差異。

對CaNAD9基因的DNA和cDNA序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)在保持系和不育系中，從DNA轉(zhuǎn)錄生成cDNA過程中均未發(fā)生RNA編輯現(xiàn)象，并且該基因在不育系和保持系的擴增片段完全一致。

根據(jù)保持系以cDNA為模板的PCR擴增結(jié)果，對所推導的CaNAD9蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進行預測，蛋白的保守結(jié)構(gòu)域為Respiratory- chain NADH dehydrogenase，推測其屬于Com plex130 KDa超家族（圖3）。預測CaNAD9蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含49個α-螺旋（25.79%），42個延伸鏈結(jié)構(gòu)（22.11%），14個β-轉(zhuǎn)角（7.37%），85個無規(guī)則卷曲（44.74%）。預測的該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（圖4）。

辣椒CaNAD9基因在辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B中的氨基酸序列無差異推導出來的氨基酸序列與GenBank中天仙子（YP_ 009121979.1）、煙草（BAD83545.2）、番茄（ATD 51567.1）、馬鈴薯（CAA56168.1）、酸漿（AKZ 24878.1）的NAD9氨基酸序列具有相似性（圖5）。

利用辣椒CaNAD9氨基酸序列與天仙子（YP_009121979.1）、煙草（BAD83545.2）、番茄（ATD51567.1）、馬鈴薯（CAA56168.1）、酸漿（AKZ24878.1）的NAD9氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明辣椒的CaNAD9氨基酸序列與天仙子、酸漿的親緣關(guān)系較近，與其他物種的親緣關(guān)系稍遠（圖6）。

2.2? CaNAD9基因在9704B多組織及在9704A與9704B花蕾不同發(fā)育時期的表達分析

6個組織中CaNAD9基因均有表達，CaNAD9基因在不同組織中表達量的差異較為明顯，其中在種子中的表達量最高，在胎座中的表達量最低（圖7）。

利用實時熒光定量的方法，以辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B為材料，選取盛花期4個不同發(fā)育階段的花蕾，對CaNAD9基因的表達量進行分析，管家基因ACTIN作為校正。結(jié)果表明，CaNAD9基因的表達量在胞質(zhì)雄性不育系與保持系中存在一定差異，在花粉母細胞減數(shù)分裂期辣椒胞質(zhì)雄性不育系與同型保持系中的表達差異最為顯著。伴隨著小孢子的發(fā)育過程，辣椒保持系中CaNAD9基因的表達水平差異明顯，在花粉母細胞減數(shù)分裂時期CaNAD9的表達水平急劇下降，表達量達到最低，與同型不育系9704B花蕾發(fā)育不同時期的表達量相差不大。與保持系相比，不育系中CaNAD9在花粉母細胞減數(shù)分裂時期的表達量下降不明顯，表達量高出不育系500倍左右。在小孢子單核期及小孢子成熟期其表達水平相差不大。在不同材料花蕾發(fā)育的同一時期，CaNAD9基因的表達也存在一定差異：在小孢子單核靠邊期與小孢子成熟期不育系和同型保持系中CaNAD9基因的表達水平相差較小;在花粉母細胞減數(shù)分裂期，CaNAD9基因的表達水平在辣椒胞質(zhì)雄性不育系中明顯高于同型保持系;小孢子單核靠邊期CaNAD9基因的表達水平在辣椒胞質(zhì)雄性不育系中略低于同型保持系;小孢子成熟期CaNAD9基因的表達水平在辣椒胞質(zhì)雄性不育系中略高于保持系（圖8）。

3? 討論

本研究分別從辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B中克隆出了CaNAD9基因，比對分析表明CaNAD9基因在辣椒胞質(zhì)雄性不育與同型保持系之間具有高度的保守性，兩系中同一基因的堿基序列具有高度一致性，在胞質(zhì)雄性不育系中沒有發(fā)生任何突變、缺失、重組的現(xiàn)象。初步推測辣椒CaNAD9蛋白屬于Complex1_ 30 KDa超家族，根據(jù)進化樹顯示，辣椒CaNAD9氨基酸序列與天仙子和酸漿的親緣關(guān)系較為接近，與煙草、番茄、馬鈴薯的氨基酸序列相似但是親緣關(guān)系稍遠。

NADH脫氫酶是線粒體生物氧化的第一步，催化電子傳遞給輔酶Q的一種酶，啟動電子傳遞鏈的正式運輸。這幾個基因功能表達的正常與否，與線粒體功能的正常運作密不可分。植物線粒體基因組中大概含有60個開放閱讀框（open reading frame， ORF），重組產(chǎn)生的開放閱讀框大多數(shù)與植物的雄性不育有著密切的關(guān)系[15]。線粒體的ORF常是線粒體未知與已知區(qū)域的嵌合基因，且該嵌合序列常來源于線粒體保守區(qū)域的基因或非編碼RNA，如K型-CMS小麥中發(fā)現(xiàn)的Ks3基因，它含有的ORF編碼許多線粒體呼吸鏈復合體的亞基，如ATP4、ATP6、NAD3、NAD9、COX1、COX3等[16]。來自復合體I的NAD7和NAD9分別在野生型水稻RT98A和煙草CMS Ⅰ、Ⅱ中分別被鑒定。煙草CMS Ⅰ中NAD7的外顯子和CMS Ⅱ中的整個NAD7的缺失導致細胞質(zhì)雄性不育[17]。水稻中NAD9和ORF113在某一區(qū)域顯示相同的序列[18]。

Schnable P S， Wise R P. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J]. Trends in Plant Science， 1998， 3（5）： 175-180.

Liu H， Cui P， Zhan K， et al. Comparative analysis of mitochondrial genomes between a wheat K-type cytoplasmic male sterility line and its maintainer line[J]. BMC Genomics， 2011， 12（1）： 163.

Gutierres S， Sabar M， Lelandais C， et al. Lack of mitochondrial and nuclear-encoded subunits of complex I and alterations of the respiratory chain in Nicotiana sylvestris mitochondrial deletions mutants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1997， 94（7）： 3436-3441.

Igarashi K， Kazama T， Motomura K， et al. Whole genomic sequencing of RT98 mitochondria derived from Oryza rufipogon and northern blot analysis to uncover a cytoplasmic male sterility-associated gene[J]. Plant and Cell Physiology， 2013， 54（2）： 237-243.

王永勤， 曹家樹， 虞慧芳， 等. 白菜核雄性不育兩用系生理生化特性的分析[J]. 園藝學報， 2003（2）： 212-214.

Villarreal F， Martín V， Colaneri A， et al. Ectopic expression of mitochondrial gamma carbonic anhydrase 2 causes male sterility by anther indehiscence[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 70（4）： 471-485.

梁? 崢， 鄭光植. 植物呼吸代謝多條路線與代謝工程[J]. 植物生理學通訊， 1994（4）： 290-292.

鄒立基. 植物呼吸作用教學的體會[J]. 植物生理學通訊， 1991（4）： 303-305.

肖敬平， 湯佩松. 對植物整體呼吸代謝和能力系統(tǒng)的探索[J]. 植物生理學通訊， 1987（1）： 73-77.

薛應(yīng)龍. 第十二講 呼吸代謝的生理意義及調(diào)控問題[J]. 植物生理學通訊， 1980（1）： 60-72.

邱義蘭， 劉珠麗， 李? 紅， 等. 辣椒細胞質(zhì)雄性不育花藥敗育及淀粉粒分布的細胞學觀察[J]. 分子細胞生物學報， 2008（4）： 283-293.