酶促油酸乙酯與棕櫚硬脂酯交換合成OPO工藝研究

宗 蕾，畢艷蘭，程亞鵬

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)是人乳脂肪的重要組成部分，占其總量的20%～40%[1-2]。研究表明，將OPO添加到嬰兒奶粉中能促進嬰兒對脂肪酸的吸收，有效減少鈣皂產(chǎn)生的可能，減少嬰幼兒排便困難，而且能提高嬰幼兒對于能量和礦物質(zhì)的吸收利用，減少體內(nèi)鈣、鎂離子及其他營養(yǎng)成分的缺失，促進嬰兒的體格和骨骼的自然成長[3-7]。2008年中華人民共和國衛(wèi)生部第13號公告批準(zhǔn)了OPO作為營養(yǎng)強化劑可用于嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)。根據(jù)GB 14880—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，OPO作為食品營養(yǎng)強化劑時添加量為24～96 g/kg。目前OPO型人乳脂替代品因組成和結(jié)構(gòu)與母乳脂肪相似被越來越多人信賴[8]。但國內(nèi)OPO生產(chǎn)工藝尚不成熟，馬來西亞Loders Croklaan公司的BetapolTM和瑞典Advanced Lipid公司的InfatTM嬰兒奶粉用油脂幾乎占據(jù)了我國OPO產(chǎn)品的全部市場[9]。因此，提高自主知識產(chǎn)權(quán)，完善生產(chǎn)工藝，研發(fā)出高品質(zhì)的OPO產(chǎn)品，打破國外產(chǎn)品的市場壟斷迫在眉睫。

酶法制備OPO的方法可以分為酯化法、酸解法和轉(zhuǎn)酯法。Pfeffre等[10]先將棕櫚酸甘油三酯轉(zhuǎn)化成為2-棕櫚酸甘油一酯，然后通過脂肪酶CALB催化2-棕櫚酸甘油一酯與油酸酯化反應(yīng)合成OPO，制得OPO的純度為95%，得率為90%。該法雖然能合成較高純度的OPO，但增加了甘一酯的制備與純化工序，增加了生產(chǎn)成本。Nagao等[11]將棕櫚酸甘油三酯與油酸按質(zhì)量比1∶2混合均勻，加入8%熱穩(wěn)定性脂肪酶R275A，在50℃下反應(yīng)24 h，得到36%的OPO。Qin等[12]發(fā)現(xiàn)在豬油和油酸摩爾比為1∶4，6%的專一性固定化脂肪酶的催化作用下，45℃反應(yīng)6 h可得到純度為43.7%的OPO產(chǎn)品?？紤]到宗教信仰問題，以豬油為原料生產(chǎn)的OPO產(chǎn)品市場受到一定限制。Silva等[13]通過脂肪酶Lipozyme TL IM催化豬油和大豆油的混合物發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，制備的產(chǎn)品物理特性與人乳脂相似，但脂肪酸組成和脂肪酸結(jié)構(gòu)與人乳脂存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂肪酸甲酯或乙酯作為?；w時，相對于脂肪酸作為?；w有更高的插入率，同時具有較低的?；D(zhuǎn)移[14-16]。Lee等[17]發(fā)現(xiàn)用脂肪酶Lipozyme TL IM，在油酸乙酯與棕櫚酸甘油三酯摩爾比5.5∶1、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間3 h條件下，獲得的OPO含量為31.43%。但作者只對OPO含量及?；w移率進行了研究，并未分析sn-2位脂肪酸的變化。

隨著育種技術(shù)的發(fā)展，高油酸油料(花生、油菜籽、大豆) 已成功上市[18]。其中，高油酸花生油中油酸含量約80%，可作為合成OPO的理想原料。本研究利用高油酸花生油為原料制備高油酸花生油脂肪酸乙酯，在sn-1,3專一性酶的催化作用下與棕櫚硬脂酯交換合成OPO，以期為提高高油酸花生油的附加值和研發(fā)OPO產(chǎn)品提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

棕櫚硬脂，豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)有限公司提供；高油酸花生油，購自山東魯花集團鄭州分公司。Novozym 40086酶(一種來源于米赫根毛霉，固定在樹脂上的1,3特異性脂肪酶，活力275 IUN/g)，購自丹麥諾維信公司。

正己烷，色譜純；薄層層析硅膠，化學(xué)純；無水硫酸鈉、冰醋酸、鹽酸、乙醚、氯化鈣、正己烷、2′,7′-二氯熒光素，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；6890N、7890B氣相色譜儀，安捷倫(美國)科技有限公司；BSA224S分析天平；TDL-80-2B離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 高油酸花生油脂肪酸乙酯制備

參考程亞鵬等[19]的方法。醇解高油酸花生油得到富含脂肪酸乙酯的混合物，通過減壓旋蒸、分液、水洗、減壓旋蒸脫水得到產(chǎn)物脂肪酸乙酯，充氮氣后冷藏備用。

1.2.2 OPO的制備

按一定摩爾比稱取高油酸花生油脂肪酸乙酯和棕櫚硬脂(總質(zhì)量20 g)于100 mL圓底燒瓶中，于一定溫度下油浴磁力攪拌(400 r/min)至完全互溶，并保持5 min，加入一定量的酶(以底物總質(zhì)量計)，反應(yīng)一定時間后，冷卻至室溫。靜置分層取出上清反應(yīng)產(chǎn)物置于25 mL試管中，取樣進行分析。

1.2.3 脂肪酸組成分析

(1)高油酸花生油脂肪酸乙酯和棕櫚硬脂的脂肪酸組成分析：按照GB 5009.168—2016甲酯化方法處理后，進氣相色譜分析脂肪酸組成。

(2)產(chǎn)物甘三酯總脂肪酸組成分析：參考Zou等[20]的方法，采用薄層板分離技術(shù)分離甘三酯。將得到的甘三酯按照GB 5009.168—2016甲酯化方法處理后，進氣相色譜分析脂肪酸組成。

(3)產(chǎn)物甘三酯sn-2脂肪酸組成分析：參考畢艷蘭等[21]的方法，通過豬胰脂酶水解1.2.3(2)得到的甘三酯得到水解物，采用薄層板分離技術(shù)分離水解物中的甘一酯。將得到的甘一酯按照GB 5009.168—2016進行甲酯化處理后，進氣相色譜分析sn-2脂肪酸組成。

氣相色譜條件：Agilent 6890N氣相色譜儀；SGE BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×25.0 μm)；載氣為高純氮氣，流速0.2 mL/min；進樣口溫度250℃；柱箱溫度為初始170℃， 2℃/min升至210℃保持5 min；氫火焰離子化檢測器溫度300℃；分流比30∶1；進樣量1 μL。使用面積歸一化法分析各脂肪酸相對含量。

2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量按下式計算。

2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量=sn-2位棕櫚酸含量/(3×所有棕櫚酸含量)×100%

1.2.4 甘三酯組成分析

用3 mL色譜純正己烷溶解棕櫚硬脂或反應(yīng)產(chǎn)物20 mg，經(jīng)無水硫酸鈉除水后過濾膜注入氣相小瓶中，用氣相色譜儀分析甘三酯組成。

氣相色譜條件：Agilent 7890B氣相色譜儀；DB-1ht色譜柱(28.0 m×250 μm ×0.1 μm)；載氣為高純氮氣，流速3 mL/min；進樣口溫度350℃；柱箱溫度為初始100℃，50℃/min升至300℃保持5 min，20℃/min升至360℃保持15 min；氫火焰離子化檢測器溫度350℃；分流比20∶1；進樣量1 μL。使用面積歸一化法分析各甘三酯相對含量。

1.2.5 理化指標(biāo)的測定

酸價的測定參照GB 5009.229—2016；過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016；水分及揮發(fā)物的測定參照GB 5009.236—2016。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用線性擬合軟件Origin 8.5軟件分析數(shù)據(jù)之間的線性關(guān)系。實驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式表示，每組實驗至少有兩個平行樣，并且進行方差分析。平行樣品間的差異用SPSS 16.0 Duncan軟件進行顯著性分析確定，P<0.05則認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)底物分析

2.1.1 高油酸花生油脂肪酸乙酯組成

高油酸花生油脂肪酸乙酯理化指標(biāo)分析結(jié)果見表1，脂肪酸組成及含量見表2。

表1 高油酸花生油脂肪酸乙酯的理化指標(biāo)

表2 高油酸花生油脂肪酸乙酯脂肪酸組成及含量 %

由表1和表2可知，高油酸花生油脂肪酸乙酯理化指標(biāo)良好，脂肪酸乙酯中油酸含量高達78.08%，可作為良好的酰基供體。

2.1.2 棕櫚硬脂組成

棕櫚硬脂理化指標(biāo)分析結(jié)果見表3，甘三酯組成及含量見表4，脂肪酸組成見表5。

表3 棕櫚硬脂的理化指標(biāo)

表4 棕櫚硬脂甘三酯組成及含量 %

注：PPP為sn-PPP；PPO為sn-PPO、sn-POP、sn-OPP的混合物；OPO為sn-OPO、sn-OOP、sn-POO的混合物；OOO為sn-OOO。

表5 棕櫚硬脂的脂肪酸組成及含量 %

由表3～表5可知，底物棕櫚硬脂的理化指標(biāo)良好，且棕櫚硬脂中PPP含量為64.87%，棕櫚酸含量達到78.67%，sn-2位棕櫚酸含量為68.80%，是合成OPO的理想原料。

2.2 酶法合成OPO單因素實驗

2.2.1 底物摩爾比的影響

將高油酸花生油脂肪酸乙酯(以下簡稱油酸乙酯)與棕櫚硬脂分別按摩爾比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1混合，均加入8%的酶，70℃反應(yīng)4 h，結(jié)果見圖1。

注：每條線上的不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)，下同。

圖1 底物摩爾比對合成效果的影響

由圖1可知，底物摩爾比由2∶1增至6∶1的過程中，OPO含量、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量先增加而后穩(wěn)定，PPP含量先減少后穩(wěn)定。底物摩爾比由2∶1增至5∶1，OPO含量從(36.0±0.1)%增加到(41.1%±0.1)%(P<0.05)，這是因為油酸乙酯濃度增加，促進反應(yīng)向正反應(yīng)方向進行；繼續(xù)增加底物摩爾比至6∶1時，OPO的含量無顯著性變化，穩(wěn)定在(41.2±0.1)%，此時2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量穩(wěn)定在(49.3±0.0)%，PPP含量穩(wěn)定在(5.0±0.7)%。這一結(jié)果與葉玉蘭[22]酶法合成OPO的研究結(jié)果相似。過多的油酸乙酯不利于產(chǎn)物的分離，同時增加生產(chǎn)成本，故選擇底物摩爾比為5∶1。

2.2.2 反應(yīng)時間的影響

將油酸乙酯與棕櫚硬脂按摩爾比5∶1混合，加入8%的酶，70℃分別反應(yīng)0.5、1、2、4、6 h，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時間對合成效果的影響

由圖2可知，反應(yīng)時間由0.5 h延長至6 h過程中，OPO含量、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量先增加后減少，PPP含量先穩(wěn)定后減少。隨著反應(yīng)時間由0.5 h延長至1 h時，反應(yīng)向正反應(yīng)方向進行，目標(biāo)產(chǎn)物OPO含量顯著增加，且在1 h時反應(yīng)達到平衡。此時，OPO含量為(44.1±0.1)%、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量為(56.3±0.9)%，兩者含量均為最大值，此時PPP含量為(6.1±0.1)%；隨著反應(yīng)時間的繼續(xù)延長，反應(yīng)過程中酰基轉(zhuǎn)移程度升高，在反應(yīng)時間為1～4 h之間，反應(yīng)過程中OPO發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移，sn-2位棕櫚酸遷移到sn-1,3位，即2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量顯著降低。綜合考慮，選擇反應(yīng)時間為1 h。

2.2.3 加酶量的影響

將油酸乙酯與棕櫚硬脂按摩爾比5∶1混合，分別加入2%、4%、6%、8%、10%的酶，70℃反應(yīng)1 h,結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對合成效果的影響

由圖3可知，加酶量由2%增至10%的過程中，OPO含量、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量先增加后穩(wěn)定，PPP含量先減少后穩(wěn)定。隨著加酶量由2%增至6%，酶與底物接觸面積增大，正反應(yīng)進程加快，OPO含量從(34.3±0.2)%顯著增加至(44.0±0.1)%，2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量從(49.2±1.5)%顯著提高到(57.1±1.5)%；加酶量從6%增加至10%，OPO含量穩(wěn)定在(44.1±0.1)%，2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量、PPP含量分別穩(wěn)定在(56.4±0.5)%、(6.0±0.3)%。這是因為當(dāng)加酶量增加到一定值，反應(yīng)進入穩(wěn)態(tài)，這與蔣與燕等[23]酶法催化生產(chǎn)OPO的研究類似。適量的脂肪酶可在保證反應(yīng)速率的前提下，減少副產(chǎn)物的生成，降低生產(chǎn)成本。綜合考慮，選擇加酶量為6%。

2.2.4 反應(yīng)溫度的影響

將油酸乙酯與棕櫚硬脂按摩爾比5∶1混合，加入6%的酶，分別在50、60、70、80、90℃反應(yīng)1 h，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對合成效果的影響

由圖4可知，反應(yīng)溫度由50℃升高至90℃過程中，OPO含量先增加后減少，2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量先趨于穩(wěn)定后減少，PPP含量先降低后增加。隨著反應(yīng)溫度由50℃升高至60℃時，棕櫚硬脂完全溶解，與油酸乙酯的互溶性增大，酶與反應(yīng)底物充分混合，正反應(yīng)速率增加，OPO含量由(42.5±0.1)%顯著增加至(43.9±0.0)%，PPP含量由(8.0±0.0)%顯著降低至(6.2±0.0)%。脂肪酶的最適溫度為70℃[24]，所以當(dāng)反應(yīng)溫度由80℃升高至90℃，OPO含量由(43.2±0.3)%顯著降低至(42.4±0.3)%、PPP含量由(6.4±0.1)%顯著升高至(7.2±0.1)%；由于在較高溫度下脂肪酶催化反應(yīng)中?；w移增加[25]，2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量由(56.3±0.9)%顯著降低至(52.4±0.2)%。隨著反應(yīng)溫度由60℃升高至80℃時，OPO含量、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量、PPP含量均無顯著性變化(P>0.05)。根據(jù)Novozym 40086酶的使用要求，選擇反應(yīng)溫度為60℃。

2.3 酶法合成OPO響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，固定反應(yīng)溫度為60℃，以O(shè)PO含量(Y1)、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量(Y2)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面實驗對影響OPO合成效果的底物摩爾比(A)、加酶量(B)、反應(yīng)時間(C)進行優(yōu)化。響應(yīng)面實驗因素及水平如表6所示，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果如表7所示，方差分析如表8、表9所示。

表6 響應(yīng)面實驗因素及水平

表7 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design Expert 8.0軟件對表7中OPO含量、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y1=-20.32+16.52A+1.86B+0.29C-0.12AB-4×10-3AC-0.01BC-1.33A2+0.01B2-1.07×10-3C2，Y2=30.05+1.22A-0.20B+0.61C+1.05AB+0.02AC-2.12×10-3BC-0.68A2-0.33B2-5.86×10-3C2。

由表8、表9可知，OPO含量、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量模型顯著(P<0.01)，失擬項均不顯著(P>0.05)，說明模型可以很好地預(yù)測OPO含量及2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量。底物摩爾比、加酶量、反應(yīng)時間對OPO含量影響均顯著；影響2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的主次順序為加酶量>底物摩爾比>反應(yīng)時間,且反應(yīng)時間的影響不顯著。

表8 OPO含量的方差分析

表9 2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量的方差分析

由擬合方程得到響應(yīng)面實驗優(yōu)化的最佳條件為油酸乙酯與棕櫚硬脂摩爾比6∶1、反應(yīng)時間1 h、加酶量8%，在此條件下OPO含量預(yù)測值為46.70%，2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量預(yù)測值為60.82%。經(jīng)過實驗驗證，產(chǎn)物甘三酯中OPO含量為(46.30±0.03)%，2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量為(60.70±0.23)%，PPP含量為(5.67±0.30%),均符合GB 30604—2015標(biāo)準(zhǔn)，合成效果良好，故用脂肪酶催化高油酸花生油脂肪酸乙酯和棕櫚硬脂酯交換制備OPO的方法可行。另外，OPO含量和2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量實驗值與預(yù)測值相近，表示響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到的方案可靠。

3 結(jié) 論

本文以高油酸花生油脂肪酸乙酯和棕櫚硬脂為原料，采用脂肪酶催化酯交換合成OPO產(chǎn)品。通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到最佳反應(yīng)條件為高油酸花生油脂脂肪酸乙酯與棕櫚硬脂摩爾比6∶1、反應(yīng)溫度60℃、加酶量8%(以底物總質(zhì)量計)、反應(yīng)時間1 h，在此條件下OPO含量為(46.30±0.03)%、2位棕櫚酸占所有棕櫚酸含量為(60.70±0.23)%、PPP含量為(5.67±0.30)%。OPO的各項指標(biāo)符合GB 30604—2015，且工藝簡單，合成時間短，提高了生產(chǎn)效益，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。由于反應(yīng)產(chǎn)物中含有未反應(yīng)的高油酸花生油脂肪酸乙酯、棕櫚硬脂以及產(chǎn)生的甘一酯、甘二酯，因此需要進一步純化甘三酯。