檢測與診斷技術要點（第二版）（下）

（接上期）

3.3.3 鑒別診斷 非洲豬瘟的臨床表現(xiàn)多樣，嚴重程度也不一樣，ASF 臨床癥狀與古典豬瘟（CSF）、豬丹毒癥、沙門氏菌病、放線桿菌病、其他敗血癥、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）的臨床癥狀非常類似，有時候容易混淆（詳見表1）。

3.3.4 發(fā)現(xiàn)疑似病例需采取的行動 發(fā)現(xiàn)疑似病例，應立即按照《非洲豬瘟防治技術規(guī)范》和《非洲豬瘟疫情應急預案》要求上報疫情。

3.4 樣品采集

3.4.1 采樣方法 有效而準確地采集ASF 樣品是實現(xiàn)ASF 快速精準檢測的關鍵步驟。當疫情暴發(fā)（被動監(jiān)測）時，應針對患病豬、死亡豬及豬舍環(huán)境進行采樣；而在常規(guī)監(jiān)測時，應對ASFV易感豬群及環(huán)境（如出豬臺、場區(qū)大門等風險較大的地方）進行采樣；如果是針對精準清除的群體，采樣的數(shù)量可以適當加大。采樣應注意避免交叉污染，并在采集每頭豬只后更換一次性手套。觸碰豬只、料槽、欄桿后，應及時更換一次性手套。采血時，必須做到每采集1 頭豬只更換1 個新的針頭，以免造成ASFV 傳播。提交到診斷實驗室的相關樣品應有清晰且保存持久的標簽，樣品質量良好。所有采樣后的防護用品必須經焚燒或高壓處理。

3.4.2 樣品類型

3.4.2.1 口鼻拭子 將每頭豬口、鼻拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢測的準確性和減少工作量。拭子裝于Eppendorf管內，建議將樣品保存于4 ℃，立刻送檢，沒有實驗條件的應在24 h內送至有資質的實驗室。

3.4.2.2 全血 采血過程中應保持無菌操作。采血前，先用酒精棉對采血部位進行局部消毒。采血完畢，進行局部消毒并用干棉球按壓止血。使用含有抗凝血劑（EDTA-紫色蓋）的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈或耳緣靜脈抽取全血。如果動物已經死亡，可立即從心臟中采血。避免使用含肝素的真空采血管（綠色蓋子）。

3.4.2.3 血清 使用未加抗凝劑（紅色蓋子）的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈、耳緣靜脈采血，或剖檢過程收集血液樣品。靜置分離后，收集血清。如果血清是紅色，表明樣品發(fā)生了溶血。通常已經死亡動物的血液樣品易發(fā)生溶血。

血清樣品在分離后可以立即開展檢測，如果需要儲存，對于抗體檢測，儲存在-20 ℃，但是對于病毒檢測，最好儲存于-80 ℃。

3.4.2.4 器官和組織樣品 可采集脾臟、淋巴結、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟樣品。脾臟和淋巴結的病毒含量最高。對于死亡時間較長的動物，可采集骨髓樣品，也可采集關節(jié)內組織液。建議將樣品保持在4 ℃，盡快提交給實驗室。如無法及時送樣，可將樣品儲存在冷庫或液氮中。樣品用10%緩沖福爾馬林浸泡30 min 以上，病毒可被滅活，可用于PCR檢測。

表1 非洲豬瘟與其他相似豬病的鑒別診斷

樣品的最小需求量：血清1 mL；全血1 mL；組織樣品10 g。

3.4.2.5 環(huán)境樣品 可多點采集養(yǎng)殖場軟蜱等媒介和環(huán)境拭子，如糞便、泔水、飼料等。

3.4.2.6 其他環(huán)境樣品 以區(qū)塊為單位，按風險等級進行區(qū)域采樣。豬場內所有墻體、地面、設備等表面進行全覆蓋采樣。

生產區(qū)內：包括各區(qū)間豬舍內所有區(qū)間單元墻體、地面、風機、地溝、設備、水線、料線、門、窗、濕簾、飲用水等。采樣應全覆蓋包括死角、料槽底部等不易采集到的位置。

生產區(qū)外：對可能的風險區(qū)域進行采樣，包括地面、草坪、風機口、污水池、發(fā)酵大棚、出豬臺、場區(qū)大門、料塔、下水道、員工宿舍、儲物間、浴室、辦公室、餐廳廚房、車輛、水源等所有可能受到污染的區(qū)域。

場周邊區(qū)：豬場周圍道路。

建議所有樣品在4 ℃以下保存。

3.4.2.7 軟蜱等媒介樣品 鈍緣蜱可以用于檢測ASFV。有三種收集技術：手動收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應讓蜱保持存活或直接儲存在液氮中，避免DNA降解。

3.4.3 發(fā)生ASF后豬場復養(yǎng)前的采樣要點

3.4.3.1 采樣位點

（1）全覆蓋采樣：以區(qū)塊為單位，對其內部所有墻體、地面、設備等表面進行全覆蓋采樣。

（2）重點位點采樣：作為全覆蓋采樣方法的補充，包括死角、料槽底部等不容易采集到的位置。

3.4.3.2 采樣時間點

（1）初步清洗完成后采樣檢測，了解當前具體污染程度，并為下一步清洗消毒工作提供參考。

（2）徹底清洗完成后采樣檢測，評估清洗效果。

（3）消毒后采樣檢測（細菌培養(yǎng)＋ASFV核酸檢測），評估消毒效果。

（4）后備豬全面進場前采樣檢測。

（5）復檢檢測。

3.4.3.3 哨兵豬的使用

（1）哨兵豬實驗，是成功復產的關鍵。哨兵豬實驗的步驟：選擇一部分動物；實驗室檢測確認這些動物無非瘟病毒和其他主要豬病病原；安排運輸，確保運輸車輛非瘟病毒陰性；征召愿意在場內封閉生活60 d的員工；向場內運送足夠60 d 使用的飼料；實驗室檢測確認飼料和水都是非瘟病毒陰性；運送動物（數(shù)量約為正常生產時的5%～10%）；運送用的卡車應該清洗、消毒并在近期內停止使用。

（2）哨兵豬的檢測：哨兵豬飼養(yǎng)期間，進行三次檢測，分別在15d、30 d、60 d進行病原學檢測，哨兵豬檢測合格且無臨床癥狀的豬場，才可以考慮進行復養(yǎng)。

3.5 樣品的記錄、保存、包裝和運送

3.5.1 注意事項 為保證準確診斷，必須在適當溫度下以最快速度將樣品仔細包裝，做好標記和相關記錄，以最快路線送到最近的農業(yè)農村部指定的實驗室。樣品運輸必須遵守農業(yè)農村部《高致病性動物病原微生物菌（毒）種運輸包裝規(guī)范》等規(guī)定。

采樣之前必須致電相關實驗室，確保遵循正確的樣品提交程序，保證所送樣品能在第一時間完成檢測及儲存。

做好樣品運輸過程中的安全保障工作，避免在運輸途中感染其他動物，避免樣品被污染。

運送的樣品必須附有足夠數(shù)量的冷卻材料（如冰袋），以防變質。

3.5.2 采樣信息記錄

3.5.2.1 采樣同時，應填寫采樣單；采樣單應用鋼筆或簽字筆逐項填寫（一式三份）；樣品標簽和封條應用簽字筆填寫；保溫容器外封條應用鋼筆或簽字筆填寫；小塑料離心管上可用記號筆做標記；應將采樣單和病史資料裝在塑料包裝袋中，并隨樣品送實驗室，每個樣品能對應到來源動物。

3.5.2.2 樣品信息至少應包括以下內容：畜主姓名和養(yǎng)殖場地址；養(yǎng)殖場飼養(yǎng)動物品種及數(shù)量；疑似或被感染動物或易感動物種類及數(shù)量；首發(fā)病例和繼發(fā)病例的日期；感染動物在畜群中的分布情況；死亡動物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動物數(shù)量及年齡；臨床癥狀及其持續(xù)時間，死亡情況和時間等；飼養(yǎng)類型和標準，包括飼料來源等；送檢樣品清單和說明，包括病料種類、保存方法等；動物免疫和治療史；送檢者的姓名、地址、郵編、電話和郵箱；送檢日期；采樣人和被采樣單位簽章。

3.5.3 樣品包裝要求

3.5.3.1 采集好的樣品應仔細進行包裝，做好標記并送到實驗室。樣品應使用“三重包裝系統(tǒng)”，并正確標記，以防止泄漏，內附采樣單。保障運輸過程中的生物安全，并避免樣品受到污染。

3.5.3.2 直接盛裝容器。樣品應該儲存在密封、無菌的主容器中，根據檢驗樣品性狀及檢驗目的選擇不同的容器。每個樣品容器外應做好標記，注明樣品名、樣品編號、采樣日期等，要能明確識別來自于哪只動物。

3.5.3.3 二次包裝。吸收材料也應放置在二次容器內。如果將多個易碎的主容器放置在單個二次容器中，則必須單獨包裝或分離，以防止相互接觸。二次包裝容器應貼封條，封條上應有采樣人簽章，并注明貼封日期，標注放置方向。

3.5.3.4 堅硬的外部包裝。外包裝在盛裝液體的情況下不得超過4 升，在固體物質的情況下不得超過4 kg（不包括冰的重量）。樣品必須保持4 ℃溫度或更低溫度，并就近送動物疫病預防控制機構進行保存。注意：切勿凍結全血或混合有血凝塊的血清。

外包裝標簽和標記：“B類感染物質”標簽，其正確的運輸名稱旁邊標注“B 類感染物質”；采樣負責人的全名、地址和電話號碼；實驗室聯(lián)系人的全名、地址和電話號碼；標簽上標明“在4 ℃”、“在-20 ℃”或“在-80 ℃”保存。

3.6 廢棄物處理 采樣結束后，做好動物尸體、場地、物品、個人防護用品的消毒和無害化處理。對不同場點盡量安排不同的采樣人員，避免交叉污染。

4 實驗室診斷與確診

4.1 快速精準檢測（表2）

表2 非洲豬瘟實驗室診斷技術

4.1.1 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測 這是實驗室快速檢測ASFV 的常用方法。大型養(yǎng)豬企業(yè)可建設ASFV 檢測實驗室，當豬場周邊和自己豬場受到威脅時做好疫情排查與監(jiān)測，為疫情處置和精準清除提供技術支撐。開展qPCR 檢測必須配備專用的實時熒光PCR 儀和相應檢測試劑。實驗室可以根據技術標準開展ASFV 的qPCR 檢測。由于qPCR 檢測技術靈敏，極其微量的污染即可造成假陽性，對PCR 實驗室進行分區(qū)管理可以避免檢測污染。應根據條件將PCR 實驗室分為試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、產物擴增區(qū)等。

4.1.2 ASFV 抗體檢測 由于沒有疫苗，抗體的存在表明當前或過去有感染。對于急性疾病的暴發(fā)，病毒檢測（PCR）最有用，血清學診斷價值較低，因為大多數(shù)豬在抗體反應前死亡，在7～10 d內；但是如果存在幸存的豬只，特別是ASFV轉變?yōu)橹械榷玖蛘呷醵玖Χ局曛?，抗體檢測的作用凸顯。CISA-INIA 指出，在ASF 呈地方流行的區(qū)域，確診可疑病例最好用標準的血清學試驗（ELISA），結合另一種血清學試驗（IFA）或抗原檢測試驗（FAT）。

抗體檢測的樣品類型：血清（避免溶血）、血漿、豬肉浸出液、組織滲出物、口腔液（取樣方便，無創(chuàng)，但抗體水平低于血清）。建議在處理和檢測前加熱滅活血清中的ASF 病毒，OIE 推薦：56 ℃70 min或60 ℃20 min。

4.2 疫情確診 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心或省級動物疫病預防控制中心實驗室可以按要求確診ASF疫情。

（全文完）