抗GM-CSF納米抗體的篩選與鑒定

郭鵬利，周鵬，尚雨寒，周斌，張蕾，李紫晨，李山虎，季艷偉

1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850

集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）家族主要與哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞（dendritic cells，DC）和多形核吞噬細(xì)胞（如嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞）的生成有關(guān)[1-2]。該家族的3個(gè)主要成員分別為粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte CSF，G-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage CSF，M-CSF）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage CSF，GM-CSF）。其中，GM-CSF作為第一個(gè)被鑒定為可誘導(dǎo)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖分化的生長(zhǎng)因子，在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中都發(fā)揮著重要作用[3]。GM-CSF不僅能夠增強(qiáng)MHCⅠ、Ⅱ類分子及協(xié)同刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)抗原呈遞，還可以促進(jìn)DC的增殖分化和成熟，在提高DC數(shù)量的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的分布和抗原的呈遞等功能，激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[4]；此外，GM-CSF還能誘導(dǎo)抗腫瘤抗體的產(chǎn)生[5]。臨床上，GM-CSF已被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于與干細(xì)胞移植相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥的治療[6]。同時(shí)，GM-CSF也是一種炎癥因子，促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）和多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）等炎癥疾病的發(fā)生[3,7]。Taylor等研制的用于RA治療的抗GMCSF抗體藥物Namilumab（AMG203）在臨床Ⅱ期研究中表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞活性抑制作用，治療效果存在顯著的量效關(guān)系[8]。此外，一些其他抗GM-CSF抗體藥物也被廣泛用于前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等癌癥的治療[9]，而抗體實(shí)現(xiàn)藥物化的關(guān)鍵是抗體本身應(yīng)具有很強(qiáng)的親和力。

抗體小型化近年來(lái)一直是研究熱點(diǎn)，而納米抗體（nanobody，Nb）因具有相較于其他類型抗體更強(qiáng)的抗原結(jié)合能力而備受關(guān)注[10]。這是一種僅存在于駱駝科動(dòng)物（羊駝、單雙峰駱駝及美洲駝）和一些軟骨魚（鯊魚和銀鮫）體內(nèi)，天然缺失輕鏈的單域重鏈抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），其晶體結(jié)構(gòu)為橢圓形，是最小的功能性抗原結(jié)合片段[11]，體積僅為4×2.5×3 nm3，故又稱納米抗體[12-13]。相比于應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)單克隆抗體，納米抗體在理化和功能方面具有以下優(yōu)勢(shì)：納米抗體的分子小，其相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為傳統(tǒng)單克隆抗體的1/10左右，且可實(shí)現(xiàn)在微生物體內(nèi)的可溶性表達(dá)，從而大大降低制備成本[14-15]；受體與配體相結(jié)合的區(qū)域是抗體作用的重要靶位，納米抗體較傳統(tǒng)單克隆抗體具有更長(zhǎng)的CDR1和CDR3區(qū)，有更強(qiáng)的柔韌性和凸面性[16]，使其可更好地與受體表面的裂縫和腔隙相結(jié)合，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力[17-18]。

本研究中，我們通過(guò)免疫羊駝構(gòu)建納米抗體初始文庫(kù)，用噬菌體展示技術(shù)從文庫(kù)中篩選出5株不同氨基酸序列的納米抗體，原核表達(dá)納米抗體G1，并用Octet RED96系統(tǒng)測(cè)定其親和力。

1 材料和方法

1.1 材料

羊駝?dòng)赡喜蠹焉锟萍加邢薰咎峁?；GM-CSF由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；pHEN1噬菌體展示系統(tǒng)質(zhì)粒載體，大腸桿菌TG1、ER2738、BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；牛血清白蛋白（BSA）和脫脂奶粉購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；限制性內(nèi)切酶SifⅠ和NotⅠ、DL2000 DNA marker、T4DNA連接酶和輔助噬菌體M13KO7購(gòu)自TaKaRa公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的M13單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；卵清蛋白（OVA）購(gòu)自Sigma公司；酵母膏和蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid公司；淋巴細(xì)胞分離液（1.077）、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker、IPTG、卡那霉素、四環(huán)素和氨芐青霉素購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 免疫及效價(jià)測(cè)定

1.2.1 動(dòng)物免疫 采集免疫前的羊駝血液用作陰性對(duì)照。以GM-CSF為免疫原，采用頸部多點(diǎn)注射方式對(duì)羊駝進(jìn)行4輪免疫。溶解750 μg GMCSF于500 μL PBS溶液中，再與等體積弗氏完全佐劑乳化后進(jìn)行第1輪免疫，免疫劑量為750 μg/只。3周后進(jìn)行第2輪免疫，之后每隔2周加強(qiáng)免疫 1次，將 375 μg GM-CSF 溶于 500 μL PBS溶液中，與等體積弗氏不完全佐劑乳化后分別進(jìn)行第2、3、4輪免疫，免疫劑量為375 μg/只。每次免疫后第7 d，采集羊駝?lì)i靜脈血液。

1.2.2 免疫效價(jià)測(cè)定 采用間接ELISA法測(cè)定每輪免疫后羊駝抗血清效價(jià)。用PBS溶液稀釋GM-CSF至 10 μg/mL，加入 96孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4℃包被過(guò)夜；PBST洗板3次，加入3%脫脂奶粉，300 μL/孔，37℃封閉 2 h；PBST 洗板 3次，用PBS溶液倍比稀釋每一輪免疫后的羊駝抗血清，分別加入 96 孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，37℃孵育30 min，以第1次免疫前采集的羊駝血清作為陰性對(duì)照；PBST洗板3次，加入稀釋至1/10 000的鼠抗羊駝多克隆抗體，100 μL/孔，37℃孵育45 min；PBST洗板3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37℃孵育10 min；加入2 mol/L硫酸溶液，50 μL/孔，終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀讀取D450nm值。

1.3 噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建

1.3.1 總RNA提取和VHH目的基因擴(kuò)增 取第4輪免疫后的羊駝?lì)i靜脈血液，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，TRIzol總RNA抽提試劑盒提取淋巴細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)ND-1000測(cè)定其含量。以RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得VHH目的基因，再通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增VHH基因片段，并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，用凝膠回收試劑盒回收VHH目的基因。1.3.2 初始文庫(kù)的構(gòu)建 用SfiⅠ/NotⅠ對(duì)回收得到的VHH基因和pHEN1噬菌粒載體分別進(jìn)行雙酶切，再通過(guò)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組載體。通過(guò)電擊將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，共轉(zhuǎn)化12次，每次電轉(zhuǎn)后加入1 mL 37℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，37℃、250 r/min復(fù)蘇1 h，將復(fù)蘇的菌液混合后梯度稀釋，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，計(jì)算文庫(kù)庫(kù)容量。

在庫(kù)容量測(cè)定的平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落，進(jìn)行菌落PCR，鑒定初始文庫(kù)VHH基因插入率。另隨機(jī)挑選15個(gè)單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后送公司測(cè)序，分析初始文庫(kù)的多樣性。

1.3.3 初始文庫(kù)的拯救 取至少10倍庫(kù)容活細(xì)胞數(shù)的初始文庫(kù)接種于200 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)至D600nm約0.5，按20∶1（感染復(fù)數(shù)）加入M13KO7輔助噬菌體，靜置15 min，37℃、220 r/min培養(yǎng)1 h；4℃、5000 r/min離心5 min，去上清，用等體積的含 100 μg/mL 氨芐青霉素、50 μg/mL卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基重懸，30℃、220 r/min培養(yǎng) 5～8 h；4℃、8000 r/min離心10 min，取上清，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，4℃靜置過(guò)夜；4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，加入2 mL PBS溶液重懸噬菌體沉淀，即得到噬菌體展示納米抗體文庫(kù)。取10 μL測(cè)定滴度，剩余文庫(kù)加入甘油，終濃度為50%，-80℃保存，用于后續(xù)生物淘選。

1.4 噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的生物淘選與鑒定

1.4.1 噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的生物淘選 按照結(jié)合、洗滌、洗脫、擴(kuò)增的方式，對(duì)上述噬菌體展示納米抗體文庫(kù)進(jìn)行親和淘選，采用3%BSA和3%OVA交替封閉的方法降低非特異性吸附，GM-CSF的包被濃度逐輪降低，依次為100、50、25、12.5 μg/mL。淘選的具體步驟：向96孔酶標(biāo)板中加入相應(yīng)濃度的 GM-CSF，100 μL/孔，4℃包被過(guò)夜；棄上清，0.05%PBST洗板3次，加入3%BSA溶液（或3%OVA溶液），300 μL/孔，37℃封閉2 h；棄封閉液，0.05%PBST洗板3次，加入噬菌體懸液，100 μL/孔，37℃振蕩孵育 2 h；棄上清 ，0.1% PBST洗 板 10～15次 ，加 入 0.1 mol/L Gly-HCl洗脫緩沖液（pH2.2）進(jìn)行洗脫，100 μL/孔，室溫振蕩10 min，加入1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.8）進(jìn)行中和，15 μL/孔，混勻，吸出中和后的洗脫液，取10 μL測(cè)定滴度，剩余的進(jìn)行擴(kuò)增后用于下一輪淘選。

1.4.2 陽(yáng)性克隆的鑒定 從測(cè)定滴度的平板上隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行噬菌體的拯救純化，之后采用間接ELISA法鑒定陽(yáng)性克隆。用PBS溶液稀釋GM-CSF 至10 μg/mL，加入 96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃包被過(guò)夜；PBST洗板3次，加入3%脫脂奶粉，300 μL/孔，37℃封閉 2 h；PBST 洗板 3 次，加入擴(kuò)增后的噬菌體懸液，100 μL/孔，37℃孵育45min；PBST洗板6次，加入HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體單克隆抗體，100 μL/孔，37℃孵育 45 min；PBST 洗板 3次，加入 TMB 顯色液，100 μL/孔，37℃孵育 10 min；加入 2 mol/L硫酸溶液，50 μL/孔，終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀讀取D450nm值。

1.5 抗GM-CSF納米抗體G1的表達(dá)純化及鑒定

將陽(yáng)性克隆納米抗體G1的pET26b重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃靜置培養(yǎng)12 h；挑取單菌落接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；按1%的接種量接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 r/min培養(yǎng)至D600nm約0.5，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，30℃、250 r/min誘導(dǎo)表達(dá)8 h；4℃、5000 r/min離心8 min，棄上清，收集菌體；加入PBS重懸菌體沉淀，冰浴超聲波破碎菌體，破碎液于4℃、12 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀。用Ni2+-NTA親和層析柱純化重組蛋白，SDS-PAGE分析純化后的納米抗體純度，Octet RED96系統(tǒng)測(cè)定抗體的親和力。

2 結(jié)果

2.1 4輪免疫效價(jià)測(cè)定

共進(jìn)行4輪免疫，以免疫前的血清作為陰性對(duì)照，采用間接ELISA法測(cè)定每一輪免疫后的羊駝抗血清效價(jià)。結(jié)果如圖1，羊駝抗血清效價(jià)逐輪升高，但第4輪免疫較第3輪免疫效果提高不明顯，故收集第3、4輪免疫后的血清用于后續(xù)噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建。

2.2 噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建

2.2.1 總RNA提取和VHH基因擴(kuò)增 分離羊駝血清淋巴細(xì)胞，提取總RNA，采用ND-1000測(cè)定其濃度為408.6 ng/μL，RT-PCR和巢式PCR擴(kuò)增VHH基因，1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2，經(jīng)過(guò)巢式第1、2輪PCR，最終得到約500 bp的VHH基因。

2.2.2 初始文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)酶切、連接后的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1后即構(gòu)建得到初始文庫(kù)，經(jīng)測(cè)定，其庫(kù)容量為1.37×109cfu。在文庫(kù)計(jì)數(shù)的平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落，通過(guò)菌落PCR鑒定VHH基因插入率，結(jié)果見(jiàn)圖3，24個(gè)克隆全部在500 bp處出現(xiàn)目的條帶，表明VHH基因成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1，克隆效率達(dá)100%。另挑取15個(gè)單菌落擴(kuò)增后測(cè)序，用于分析文庫(kù)的多樣性，其氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖4，除1號(hào)和12號(hào)克隆氨基酸序列完全相同外，其他克隆序列差異性大，表明初始文庫(kù)呈現(xiàn)較好的多樣性。初始文庫(kù)庫(kù)容量大、多樣性好，是后續(xù)淘選出生物性能良好的納米抗體的關(guān)鍵。本研究構(gòu)建的納米抗體初始文庫(kù)有著較好的多樣性和較高的庫(kù)容量，為后續(xù)篩選出高親和力的納米抗體奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖1 羊駝抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

圖2 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證VHH基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 菌落PCR驗(yàn)證VHH基因克隆效率

圖4 初始文庫(kù)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.3 噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的生物淘選

經(jīng)過(guò)3輪淘選，隨著GM-CSF包被濃度的降低，抗GM-CSF的特異性噬菌體得到有效富集。從第3輪淘選洗脫物滴度測(cè)定平板上隨機(jī)挑選39個(gè)單克隆進(jìn)行陽(yáng)性克隆的鑒定，結(jié)果如圖5。取陰性對(duì)照D450nm值的3倍以上為陽(yáng)性克隆，共有20個(gè)克隆呈陽(yáng)性，將其全部測(cè)序，結(jié)果經(jīng)BioEdiet軟件比對(duì)分析后，共篩選到5株氨基酸序列差異性較大的納米抗體，圖6所示為其中一株的氨基酸序列，將該株納米抗體命名為納米抗體G1。

2.4 納米抗體G1的表達(dá)純化

將納米抗體G1的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后進(jìn)行表達(dá)，細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后，采用Ni2+-NTA親和層析柱純化，SDS-PAGE分析純化后的蛋白，結(jié)果如圖7，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約15×103，與理論值相符，且純化后的條帶無(wú)明顯雜帶，表明納米抗體G1純度較高。

2.5 納米抗體G1親和力測(cè)定

采用Octet RED96系統(tǒng)測(cè)定納米抗體G1的親和力，結(jié)果如圖8，其解離平衡常數(shù)KD為2.95×10-8mol/L，表明納米抗體G1與GM-CSF的結(jié)合力達(dá)到了納摩爾級(jí)，具有較強(qiáng)的親和力。

3 討論

GM-CSF已逐漸成為炎癥疾病的新型治療靶點(diǎn)，制備相應(yīng)的抗體對(duì)于相關(guān)炎癥疾病的治療具有重要意義。目前針對(duì)GM-CSF的特異性抗體多為傳統(tǒng)單克隆抗體，納米抗體的制備尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究制備得到抗GM-CSF納米抗體，且呈現(xiàn)較強(qiáng)的親和力，為后續(xù)推進(jìn)體外細(xì)胞和體內(nèi)水平上炎癥治療的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

納米抗體的分子大小僅為傳統(tǒng)單克隆抗體的1/10，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如體積小、穩(wěn)定性高，能夠穿過(guò)血腦屏障并持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)揮作用；納米抗體還可實(shí)現(xiàn)在原核生物中大量表達(dá)，可以大大降低生產(chǎn)成本，且免疫原性低[19]，在細(xì)胞中容易被清除，從而保證對(duì)人體無(wú)害。更重要的，納米抗體有著更長(zhǎng)的抗原結(jié)合互補(bǔ)區(qū)CDR1和CDR3，具有比傳統(tǒng)單克隆抗體更強(qiáng)的抗原結(jié)合能力，并且依據(jù)納米抗體易改造的特點(diǎn)，還可通過(guò)點(diǎn)突變等基因工程技術(shù)進(jìn)一步提高納米抗體的親和力[20]。而單克隆抗體由于組織滲透性差，體內(nèi)不易被清除且制備成本高，從而限制了其臨床應(yīng)用。

圖5 噬菌體陽(yáng)性克隆的鑒定

圖6 納米抗體G1的氨基酸序列

圖7 納米抗體純化后的SDS-PAGE分析

圖8 納米抗體G1親和力測(cè)定結(jié)果

納米抗體文庫(kù)的庫(kù)容量和多樣性是淘選出高特異性、高親和力納米抗體的關(guān)鍵。為了克服大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，本研究進(jìn)行了12次電擊轉(zhuǎn)化，最終文庫(kù)庫(kù)容量達(dá)1.37×109cfu，保證了文庫(kù)的多樣性。本研究采用固相淘選的方式對(duì)噬菌體展示納米抗體文庫(kù)進(jìn)行生物淘選，淘選過(guò)程中，GM-CSF的純度和包被濃度、封閉液的種類和濃度、PBST的濃度、噬菌體投入量、結(jié)合時(shí)間及洗脫時(shí)間等因素都會(huì)影響噬菌體顆粒的富集[21]。本研究采用3%BSA和3%OVA交替封閉、逐漸加大洗滌強(qiáng)度等方式提高生物淘選的特異性，還可進(jìn)一步優(yōu)化淘選條件以期獲得具有更高特異性、更高親和力的納米抗體。

綜上，本研究制備的高親和力抗GM-CSF納米抗體可用于進(jìn)一步的炎癥抗體藥物開(kāi)發(fā)。不同疾病或同一疾病不同階段，患者體內(nèi)的血清GM-CSF含量不同[22]，可通過(guò)監(jiān)測(cè)抗GM-CSF納米抗體相關(guān)反應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)臨床疾病診斷、患者危險(xiǎn)分層及疾病進(jìn)程和治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)。