miR-30a-5p通過靶向Runx2基因抑制成骨細胞分化

王如然，黃勝男，曹戩，許華穎，李宏燕，黃浩然，趙杉，王玉紅，馮艷華，徐國營，韓兵

1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū) a.外科，b.藥劑科，c.中心實驗室，d.院感科，北京 102618；2.北京市大興區(qū)西紅門醫(yī)院 外科，北京 100076

骨質(zhì)疏松癥包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退變、骨強度下降而脆性增加，容易誘發(fā)骨折[1]。因此，骨質(zhì)疏松癥的診斷和預(yù)防非常重要。成骨分化對于骨形成是一個十分重要的過程，并受多種因素的調(diào)控，比如miRNA[2]。一些miRNA可以通過靶向重要的成骨因子來抑制成骨細胞的分化。例如miR-153通過靶向骨髓間充質(zhì)干細胞中的BMPR2來減弱成骨細胞的分化[3]；miR-488通過靶向Runx2負調(diào)控補骨脂素誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[4]。因此，對miRNA的研究有助于進一步了解骨質(zhì)疏松癥的病理機制。

RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNT-related transcription factor 2，Runx2）是RUNX家族成員，是與成骨細胞分化相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是正常骨骼發(fā)育和成骨過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子[5]。miR-30a-5p在成骨細胞分化中的調(diào)節(jié)作用還未有報道，其機制尚不清楚。在本研究中，我們檢測了miR-30a-5p與成骨細胞分化標志物膠原Ⅰ、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的關(guān)系，進一步探討miR-30a-5p在成骨細胞分化中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

9周齡雌性野生型SD大鼠購自唯尚立德科技有限公司；SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）購自賽業(yè)生物科學(xué)公司；miR-30a-5p模擬物和抑制劑（mimics/inhibitor）及miRNA陰性對照購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Runx2過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Runx2購自Genearray Biotechnology公司；pMIR報告載體購自優(yōu)寶生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、1%胎牛血清購自賽默飛公司；LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒、MutanBEST試劑盒購自TaKaRa公司；ALP活性檢測試劑盒購自北京綠源博德生物科技有限公司；螢光素酶檢測試劑盒購自Beyotime Biotechnology公司；PDVF膜購自Millipore公司；Runx2抗體、GAPDH抗體和HRP標記的羊抗兔二抗均購自Abcam公司；化學(xué)發(fā)光液和凝膠成像儀購自BioRad公司；4%多聚甲醛購自上海潤捷公司；茜素紅S染色液購自Solarbio公司；miRNA測序由北京基石生命科技有限公司完成。

1.2 大鼠模型建立與分組

將9只9周齡雌性野生型SD大鼠分成雌激素組、骨質(zhì)疏松模型組及假手術(shù)組，每組3只。雌激素組和模型組大鼠均手術(shù)切除卵巢，并分別用戊酸雌二醇或生理鹽水灌胃，1/d，處理12周；假手術(shù)組切除卵巢附近部分脂肪，生理鹽水灌胃，1/d，處理12周。取大鼠骨組織測序。檢測大鼠血液中ALP和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）水平，當血清ALP水平超過 147.25±56.29 IU/mL，TRAP水平超過 24.50±1.16 IU/mL，大鼠骨質(zhì)疏松模型合格。

1.3 差異miRNA表達檢測

取大鼠骨組織，液氮凍存，交由北京基石生命科技有限公司進行miRNA測序分析，骨質(zhì)疏松大鼠模型組與雌激素組和假手術(shù)組對比，分析miRNA表達差異。

1.4 成骨誘導(dǎo)

將 BMSCs于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液，細胞融合度達60%～80%時用0.25%Trypsin-EDTA消化傳代；收集細胞，按5×103/cm2的密度接種在預(yù)先用明膠包被的六孔板中，每孔含培養(yǎng)基2 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞融合度達到60%～70%開始誘導(dǎo)，小心棄去培養(yǎng)基，并小心沿壁加入37℃預(yù)熱的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；每隔3 d更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（175 mL培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%青霉素-鏈霉素，0.2%抗壞血酸，1% β-甘油磷酸鈉和0.01%地塞米松），直至誘導(dǎo)出現(xiàn)大量礦化結(jié)節(jié)。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

將2×106BMSCs接種到6孔板中，培養(yǎng)至60%～80%融合；用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒對細胞進行單獨轉(zhuǎn)染，或者共轉(zhuǎn)染miR-NC（20 pmol）、miR-30a-5p模擬物（20 pmol）、miR-30a-5p抑制劑（50 pmol）及pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒（4 μg）。

1.6 熒光定量PCR

用TRIzol試劑分離提取總RNA，用Prime-ScriptRT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green引物進行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），GAPDH和U6分別作為 mRNA和miRNA的標準化內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算相對表達量。Runx2正向引物為5'-TCTAGGAACCTATAGGCCC TTT-3'，反向引物為5'-TGGACGGTCTTATCTTTA CA-3'；OCN正向引物為5'-CGCCGCCGAAACTA ACTC-3'，反 向 引 物 為 5'-CTAGAGTGTCCGAAT TATA-3'；OPN正向引物為5'-ATGGTATAGGGAA GCGGCAACAA-3'，反向引物為5'-CGTGCAGTGG CGCTTATCT-3'；膠原Ⅰ正向引物為5'-AGAATC CGGTTCAGGGA-3'，反向引物為5'-CTTATAGGG TGCCTTCGC-3'；GAPDH正向引物為5'-CGCTCT CTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物為5'-ATCCGT TGACTCCGACCTTCAC-3'；miR-30a-5p 正 向 引 物為 5'-AAAGTGGACATTTGTAGAGA-3'，反向引物為 5'-CAGGTACAGACGGATATCTTGC-3'；U6 正向引物為 5'-GCTTCGGCCACATATACTTTAAT-3'，反向引物為5'-CGCATCGCAGAATTTGTCTCAT-3'。

1.7 ALP活性檢測

將miR-NC、miR-30a-5p模擬物、miR-30a-5p模擬物+OE-Runx2轉(zhuǎn)染的成骨細胞分別接種到6孔板，每孔5×105細胞；細胞黏附于板底后，用成骨分化培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基；細胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d，每3 d更換一次培養(yǎng)基；用ALP試劑盒檢測細胞的ALP活性；細胞洗滌后，緩沖液重懸，用超聲波在冰上處理2次，每次30 s；將細胞以13 000 r/min離心10 min，去除不溶性物質(zhì)，收集上清液，用對氮苯磷酸二鈉法檢測ALP活性；用BCA試劑測定總蛋白濃度。

1.8 螢光素酶報告基因檢測

1.9 蛋白質(zhì)表達分析

從細胞中提取總蛋白。每個膠孔內(nèi)加入等量總蛋白，用10%SDS-PAGE分離，隨后將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，用5%的脫脂牛奶將膜封閉1 h。將Runx2和GAPDH一抗于4℃孵育過夜，PBST洗滌4次，用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，用增強化學(xué)發(fā)光法測定其特異性蛋白水平，凝膠成像儀成像。

1.10 茜素紅染色

去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞樣本2次，用4%多聚甲醛固定細胞10 min；棄去固定液，用PBS清洗細胞樣本3次，加入茜素紅S染色液染色20～30 min；吸去染色液，用PBS清洗5次，顯微鏡下觀察鈣沉積情況并拍照。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，2組獨立組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA差異表達分析

miRNA測序結(jié)果顯示，與假手術(shù)組和雌激素組相比，骨質(zhì)疏松模型組分別有65種和38種miRNA表達上調(diào)。在這2組差異miRNA集合中有35種共同的miRNA（圖1），其中表達差異排前5的miRNA分別是rno-miR-30a-5p、rno-miR-199a-3p、rno-miR-708-5p、rno-miR-30d-5p及rno-miR-708-3p，而rno-miR-30a-5p又是差異最為顯著的（表1）。因此，后續(xù)實驗選擇rno-miR-30a-5p來探討其對大鼠成骨分化的影響。

2.2 miR-30a-5p在組織中的表達

檢測結(jié)果顯示，miR-30a-5p在模型組中的表達含量最高，明顯高于在雌激素組和假手術(shù)組中的表達水平，且雌激素組和假手術(shù)組中的miR-30a-5p表達水平間沒有顯著差別。該結(jié)果與測序分析結(jié)果一致，相對于其他2組，miR-30a-5p在模型組中表達上調(diào)。

圖1 對比假手術(shù)組、雌激素組，模型組上調(diào)miRNA的韋恩圖

表1 35種上調(diào)miRNA中排名前5的miRNA

2.3 miR-30a-5p靶向調(diào)控Runx2的表達

通過TargetScan、miRanda和microT綜合檢測Runx2 3'UTR含有miR-30a-5p潛在結(jié)合位點（圖3A）。雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示miR-30a-5p模擬物顯著降低了野生型組螢光素酶活性，而對突變組螢光素酶活性基本沒有影響（圖3B）。在BMSCs中，miR-30a-5p過表達抑制了Runx2的mRNA和蛋白表達（圖3C、D）。以上結(jié)果揭示，miR-30a-5p靶向抑制了Runx2的表達。

2.4 Runx2過表達部分緩解miR-30a-5p對成骨細胞分化的抑制作用

為了進一步探究miR-30a-5p/Runx2對成骨細胞分化的影響，用miR-30a-5p模擬物、miR-30a-5p模擬物+pcDNA3.1-Runx2轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，誘導(dǎo)分化。檢測結(jié)果表明，miR-30a-5p抑制了大鼠成骨鈣礦物沉積（圖4A），抑制成骨標記蛋白OCN、OPN和膠原Ⅰ的表達（圖4C、D），降低ALP活性（圖4B）；而同時過表達Runx2后，OCN、OPN和膠原Ⅰ的表達升高，ALP活性增加，Runx2過表達部分緩解miR-30a-5p對成骨細胞分化的抑制作用。以上結(jié)果提示miR-30a-5p通過靶向調(diào)控Runx2影響成骨細胞分化。

3 討論

我們通過切除大鼠體內(nèi)雙側(cè)卵巢，降低大鼠體內(nèi)雌激素分泌水平，構(gòu)建了骨質(zhì)疏松大鼠模型，該模型引起的骨質(zhì)疏松與人類女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相近，也是FDA和WTO推薦的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的模型[6]。

圖2 miR-30a-5p在各組大鼠骨組織中的表達差異

圖3 miR-30a-5p靶向調(diào)控Runx2的表達

圖4 Runx2過表達部分緩解miR-30a-5p對成骨細胞分化的抑制作用

miRNA是一類內(nèi)生的極其豐富的非編碼RNA，幾乎參與所有的信號調(diào)節(jié)通路，與細胞增殖和成骨分化密切相關(guān)，可以靶向調(diào)控成骨分化途徑中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和受體的表達，從而影響成骨分化。例如，miR-23a-3p通過靶向調(diào)控PGC-1α，影響WNT/βcatenin信號通路，抑制成骨細胞分化與增殖[7]；miR-135a-5p通過靶向Runx2調(diào)控成骨分化，參與骨質(zhì)疏松癥的進展[8]；抑制miR-451a可加速骨質(zhì)疏松癥中成骨分化，并通過Bmp6信號途徑抑制骨丟失[9]；miR-128通過下調(diào)SIRT6的表達抑制骨質(zhì)疏松癥的成骨分化[10]。然而，一些miRNA也扮演著促進成骨分化的角色，如miR-29a通過下調(diào)DKK-1表達和激活Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞增殖[11]；miR-135-5p通過靶向MC3T3-E1細胞中的HIF1AN促進成骨細胞分化[12]。為了探究miRNA在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的作用機制，本研究通過對模型組、假手術(shù)組和雌激素組骨組織進行miRNA測序，并分析差異表達發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，假手術(shù)組和雌激素組有35種相同的miRNA下調(diào)表達，具有很好的一致性。在本研究中我們選取了最具差異性而以往較少報道的miR-30a-5p進行深入分析，通過雙螢光素酶報告基因驗證發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p靶向調(diào)控抑制Runx2的表達，進一步研究miR-30a-5p和Runx2的作用關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p過表達抑制了成骨標記蛋白OCN、OPN和膠原Ⅰ的表達，并使成骨細胞ALP活性降低；而過表達Runx2緩解了miR-30a-5p對成骨標記蛋白的抑制，促進成骨細胞分化。因此，miR-30a-5p通過靶向調(diào)控Runx2抑制大鼠成骨分化。

Runx2含有Runt DNA結(jié)合位點，可以結(jié)合特定的DNA序列，調(diào)節(jié)眾多基因表達，進而影響成骨細胞的發(fā)育[5]。它還與許多蛋白質(zhì)功能相關(guān)，如TGF-β和BMP-2[13]。此外，它通過與共調(diào)節(jié)蛋白和染色質(zhì)重塑因子相互作用，在間充質(zhì)干細胞、成骨細胞和前軟骨細胞中調(diào)節(jié)成骨細胞分化特異性基因[5,14]。據(jù)報道，Runx2調(diào)節(jié)多種成骨細胞分化相關(guān)標記物，如OCN、OPN和膠原Ⅰ[15-17]。本研究中miR-30a-5p靶向抑制Runx2的表達，進而影響到OCN、OPN和膠原Ⅰ的表達。但miRNA向來具有多靶標多功能的性質(zhì)，miR-30a-5p在骨質(zhì)疏松癥中的調(diào)節(jié)功能可能并不是靶向Runx2那樣簡單，可能聯(lián)合其他miRNA涉及更復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要進一步深入研究。

綜上，miR-30a-5p在骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中表達上調(diào)，并能夠靶向抑制Runx2的表達，從而抑制成骨細胞形成，這為骨質(zhì)疏松癥的診斷提供了新的潛在生物標志物。