基于代謝組學(xué)方法研究銀耳多糖對非酒精性脂肪肝大鼠的干預(yù)作用

張 艷,王 爽,李永哲,劉 奔,宋 爽

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林吉林 132022;2.吉林化工學(xué)院研究生院,吉林吉林 132022;3.吉林石化電石廠,吉林吉林 132022)

高血脂又稱脂質(zhì)代謝異常,主要是指血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)或血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)水平過高和/或血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)水平過低,是常見的代謝性疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食引起的脂質(zhì)代謝異常伴有肝臟脂肪變性(被稱為非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease NAFLD))的病變過程,嚴(yán)重的NAFLD很容易發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等疾病[2-3],因此控制血脂可在一定程度上有效預(yù)防NAFLD。現(xiàn)今,他汀類、貝特類等化學(xué)藥物是治療高血脂類疾病的常規(guī)藥物,雖然這些化學(xué)藥物療效顯著,但副作用明顯,易導(dǎo)致如肌痛、橫紋肌溶解癥和肝功能異常等問題[4]。因此,開發(fā)天然的降脂保肝功能性食品的需求日益增加。

銀耳(Tremella)屬于真菌類銀耳科銀耳屬,是門擔(dān)子菌門真菌銀耳的子實體,作為綠色食品的典型代表,具有較高的營養(yǎng)價值、巨大的經(jīng)濟價值與開發(fā)潛力[5]。銀耳多糖是銀耳中重要的活性物質(zhì),現(xiàn)代研究表明,銀耳多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等多種作用[6-8],然而銀耳多糖對NAFLD的干預(yù)作用和機制研究卻鮮有報道。

代謝組學(xué)是一種快速對生物體內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物進行定性、定量分析,并尋找代謝物與生理變化相對關(guān)系的學(xué)科,是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[9-10]。近年來,代謝組學(xué)在食品、營養(yǎng)科學(xué)和中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛,為以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)開發(fā)的功能性食品作用機制及其理論研究提供了強有力的現(xiàn)代化研究手段。本文借助于氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術(shù)分析NAFLD模型大鼠肝組織小分子代謝物,并通過主成分分析(principal components analysis,PCA)和正交信號校正偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)模式結(jié)合代謝組網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫,尋找銀耳多糖干預(yù)NAFLD大鼠肝勻漿的生物標(biāo)志物及作用的代謝通路,為開發(fā)銀耳多糖降脂保肝功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar雄性大鼠30只 體質(zhì)量(200±20) g,動物許可證號:SCXK(吉)2017-0001,購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心,實驗過程中遵循《實驗動物的護理和使用指南》(吉林化工學(xué)院45號文件),符合吉林省動物倫理委員會規(guī)定;銀耳多糖(純度>70%) 實驗室自制;N,O-雙三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、吡啶 上海麥克林公司;乙腈、二十二烷酸、正庚烷 北京化學(xué)試劑廠;l,2-丙二醇、吐溫-80、膽固醇 沈陽華東制劑廠;丙硫氧嘧啶 上海朝暉藥業(yè)有限公司;TC試劑盒、TG試劑盒、LDL-c試劑盒、HDL-c試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;所有有機溶劑 均為國產(chǎn)色譜純。

GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI),AOC-20i自動進樣器) 日本島津公司;HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司;H2050R型低溫高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司;Chemray240型全自動生化分析儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 江蘇天翎儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥 將大鼠按體重隨機分為空白組、模型組和銀耳多糖組,每組10只?？瞻捉M正常飼養(yǎng),自由飲水進食。模型組和銀耳多糖組給予脂肪乳灌胃,10 mL/kg,連續(xù)20 d,制備大鼠NAFLD模型。參照文獻方法[11-12]制備脂肪乳劑:取豬油25 g,放入200 mL燒杯中,加熱至100 ℃,加入25 mL吐溫-80,制成油相。在100 mL燒杯中加入30 mL蒸餾水和20 mL 1,2-丙二醇加熱,制成水相。然后將水相加入油相,充分?jǐn)嚢杌靹?待溫度降低后加入膽固醇1.0 g,丙硫氧嘧啶1.0 g,即制成脂肪乳劑。造模成功后,模型組和銀耳多糖組繼續(xù)給予脂肪乳,10 mL/kg,同時,根據(jù)前期預(yù)實驗確定銀耳多糖組給予銀耳多糖200 mg/kg(相當(dāng)于60 kg人的日用量2.2 g)灌胃,空白組和模型組給予水灌胃,連續(xù)灌胃28 d。

1.2.2 血液生化指標(biāo)的測定 末次給藥后,麻醉大鼠,腹主動脈取血,分離血清,采用全自動生化分析儀對血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c、ALT、AST和ALP進行測定。并計算動脈硬化指數(shù)(Arteriosclerosis index,AI),AI=(TC-HDL-c)/HDL-c,LDL-c/HDL-c比值及TC/HDL-c比值。

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)檢測 取部分肝臟,置4%甲醛溶液中固定,蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色法觀察肝臟組織病理形態(tài)改變。

1.2.4 采用GC-MS方法對大鼠肝勻漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的測定與分析

1.2.4.1 肝組織預(yù)處理 取肝臟0.5 g加2倍重生理鹽水研磨制成肝勻漿,放置于4 mL離心管中4 ℃下以10000 r/min離心15 min,移取上清液100 μL于1.5 mL離心管中,加入250 μL乙腈,混懸3 min混合均勻后冰浴超聲。冰浴超聲10 min后,4 ℃、12000 r/min下離心10 min,吸取上清液200 μL于1.5 mL離心管中于-55 ℃,真空度999 Pa冷凍干燥12 h。冷凍干燥后,加入50 μL衍生化試劑(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50 μL吡啶,于80 ℃水浴反應(yīng)0.5 h,1 h后加含二十二烷(內(nèi)標(biāo),0.10 g/L)的正庚烷150 μL,混勻后于12000 r/min離心15 min,移取上清液到1.5 mL離心管,用于GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS測試條件 進樣口溫度:280 ℃;分流比:10∶1;載氣:氦氣;流速:1.65 mL/min;柱箱溫度:60 ℃;柱溫程序:起始溫度60 ℃保持3 min后,以6 ℃/min升溫到290 ℃保持10 min;進樣量:0.2 μL,離子源和接口溫度分別為200和230 ℃;電子能量:0.85 eV;溶劑延遲:5.5 min;全掃描模式,掃描范圍m/z:35～600。

1.2.4.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理及分析 cdf格式的代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS Online(https://xcmsonline.scripps.edu/index.php)對得到的數(shù)據(jù)進行峰提取、峰對齊、峰匹配、峰強度校正和消除噪音等操作,將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物保留時間和質(zhì)荷比信息的csv格式文件,導(dǎo)入SIMCA-P 13.0,通過PCA分析和OPLS-DA分析,進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳多糖對NAFLD大鼠血脂和肝功能指標(biāo)的影響

根據(jù)《中國成人血脂異常防治指南》,TG≥1.70 mmol/L為高TG血癥,TC≥5.18 mmol/L為高TC血癥,LDL-c≥3.37 mmol/L為高LDL-c血癥,HDL-c≤1.04 mmol/L為低HDL-c血癥,符合其中任一項即為血脂異常[13-14]。此外,ALT和AST的含量是血清中提示肝損傷的重要指標(biāo)[15]。由表1可知,與空白組比較,模型組血清TC、TG、LDL-c、AI、LDL-c/HDL-c及TC/HDL-c水平極顯著升高(P<0.01),HDL-c水平顯著下降(P<0.05),與此同時,ALT、AST和ALP水平極顯著升高(P<0.01),表明大鼠NAFLD模型建立。與模型組比較,銀耳多糖組血清TC、AI、LDL-c/HDL-c及TC/HDL-c水平極顯著降低(P<0.01),TG和LDL-c水平顯著降低(P<0.05),HDL-c水平顯著升高(P<0.05),ALT、AST和ALP水平顯著降低(P<0.05),表明銀耳多糖具有明顯的降脂保肝作用,可以改善NAFLD大鼠的血脂異常和肝功能異常。

表1 銀耳多糖對NAFLD大鼠血脂和肝功能的影響(n=10)Table 1 Effect of Tremella polysaccharides on plasma lipid and liver function of NAFLD rats(n=10)

2.2 組織病理學(xué)檢查

病理結(jié)果(圖1)表明,空白組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝組織細胞清晰可見,無脂肪組織增生;模型組肝細胞脂肪變性明顯,伴有炎性細胞浸潤和脂肪結(jié)締組織增生;銀耳多糖組的肝組織細胞情況有明顯改善,肝組織細胞相對清晰、部分肝細胞表現(xiàn)為彌漫脂肪變性及胞漿疏松化,但大部分肝細胞結(jié)構(gòu)正常。由此可見,銀耳多糖可降低大鼠肝脂肪蓄積,減輕肝臟的脂肪變性程度。

圖1 銀耳多糖對大鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響(400×)Fig.1 Effect of Tremella polysaccharideson the pathological morphology of rats’ liver(400×)注:A:空白組;B:模型組;C:銀耳多糖組。

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 各組肝勻漿代謝輪廓分析 如總離子流(TIC)圖(圖2)所示,3組大鼠肝勻漿中代謝物均得到良好的分離,色譜峰保留時間主要集中在6～45 min,且有明顯的不同,表現(xiàn)在代謝物的保留時間及峰面積上的差異。為了進一步檢測空白組、模型組和銀耳多糖組大鼠代謝輪廓的變化情況,對3組大鼠肝勻漿代謝譜的數(shù)據(jù)進行PCA分析(圖3)。由PCA圖可以看出空白組、模型組和銀耳多糖組能夠分開并且呈明顯的聚類特征。模型組的樣本遠離空白組的樣本,而銀耳多糖組樣本更接近于空白組,說明銀耳多糖對NAFLD大鼠的異常代謝輪廓有調(diào)節(jié)作用,更趨近于空白組。

圖3 三組大鼠肝勻漿代謝組學(xué)的PCA圖Fig.3 PCA of metabolomics in three groups of rats’ liver注:▲:空白組;■:模型組;●:銀耳多糖組。

圖2 空白組、模型組及銀耳多糖組的TIC圖Fig.2 Total ion chromatography ofcontrol group,model group and TP group注:A:空白組;B:模型組;C:銀耳多糖組。

2.3.2 標(biāo)志物的鑒定 在OPLS-DA(圖4A、4C)圖中,空白組和模型組可以明顯分為兩部分,模型組和銀耳多糖組也可以明顯分為兩部分,表明組間差異遠遠大于組內(nèi)差異。在S-plot(圖4B、4D)中,S型兩端的點為潛在的生物標(biāo)志物,同時以VIP>1.0和P<0.05作為生物標(biāo)志物的判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過匹配NIST(http://webbook.nist.gov/chemistry/),METLIN(https://metlin.scripps.edu/),HMDB(http://www. hmdb. ca/)和KEGG(http://www. genome. jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫和查閱相關(guān)文獻,最終確定12個銀耳多糖治療酒精性脂肪肝的內(nèi)源性代謝物為潛在的生物標(biāo)志物(表2)。其中,與空白組比較,模型組蘋果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、檸檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、順-烏頭酸和乙酰乙酸水平顯著升高(P<0.05),甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平降低(P<0.05)。與模型組比較,銀耳多糖組蘋果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、檸檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、順-烏頭酸和乙酰乙酸水平降低(P<0.05),甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平升高(P<0.05)。上述結(jié)果表明,銀耳多糖對12個生物標(biāo)志物的異常水平均具有顯著的逆轉(zhuǎn)作用,能夠使得它們的表達趨于正常水平。

圖4 三組大鼠肝勻漿代謝組學(xué)的OPLS-DA圖和S-plot圖Fig.4 OPLS-DA and S-plot of metabolomics in three groups of rats’ liver注:A:空白組與模型組OPLS-DA圖(▲為空白組,◆為模型組);B:空白組與模型組S-plot圖;C:模型組與銀耳多糖組OPLS-DA圖(▲為銀耳多糖組,◆為模型組);D:模型組與銀耳多糖組S-plot圖。其中OPLS-DA的橫坐標(biāo)代表每個物質(zhì)在第一主成分上的載荷大小,縱坐標(biāo)代表每個物質(zhì)在第二主成分上的載荷大小;S-plot的橫坐標(biāo)代表每個物質(zhì)在第一主成分上的載荷大小,縱坐標(biāo)代表每個物質(zhì)和第一主成分相關(guān)系數(shù)(可靠性)的大小。

表2 銀耳多糖干預(yù)NAFLD大鼠的生物標(biāo)志物Table 2 Biomarkers of Tremella polysaccharides interfered with NAFLD rats

2.3.3 代謝通路分析 通過MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)的代謝通路分析篩選影響因素大于0.1的代謝通路為主要影響的代謝通路。如圖5所示,這12種標(biāo)志性代謝物主要涉及酮體的合成和代謝,乙醛和二羧酸代謝,抗壞血酸和醛酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,TCA循環(huán)和丁酸代謝6種代謝途徑。

圖5 代謝路徑分析Fig.5 Metabolic pathway analysis

NAFLD是可影響多個器官的代謝綜合征,肝臟是第一個被積累的器官,最初表現(xiàn)為肝脂肪,繼而引起包括線粒體功能障礙的繼發(fā)效應(yīng),如氧化損傷和脂肪細胞因子失衡等[16-17]。肝細胞內(nèi)脂肪的大量沉積導(dǎo)致的氧化損傷是在NAFLD的病理過程起關(guān)鍵作用[18]。氧化損傷可導(dǎo)致肝臟線粒體功能障礙并直接導(dǎo)致ATP的生成障礙[19]。TCA循環(huán)是碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的重要樞紐,也是能量代謝產(chǎn)生ATP的重要途徑[20]。蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸和順-烏頭酸是TCA循環(huán)的主要產(chǎn)物。丙酸是丙酮酸代謝的中間體,通過參與丙酮酸代謝間接影響體內(nèi)ATP的生成。D-核糖是ATP的結(jié)構(gòu)組成部分,其水平間接反映體內(nèi)能量代謝產(chǎn)生ATP情況。D-葡萄糖是機體直接利用的能量來源。山梨醇參與乳酸代謝途徑也影響能量代謝。如表2所示,與空白組比較,模型組上述生物標(biāo)志物水平均明顯升高,表明模型組大鼠能量代謝異常。此外,蘋果酸、檸檬酸和順-烏頭酸也參與乙醛酸和二羧酸代謝。模型組蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸、順-烏頭酸、丙酸、D-核糖和D-葡萄糖水平升高,山梨醇水平降低,表明模型組能量代謝異常的同時乙醛酸和二羧酸代謝也出現(xiàn)了異常。經(jīng)銀耳多糖治療后,這些生物標(biāo)志物水平有所恢復(fù),表明銀耳多糖可以調(diào)節(jié)能量代謝和乙醛酸和二羧酸代謝異常。

長期高脂肪飲食可增加脂肪含量,從而增加血液中的游離脂肪酸水平,進而導(dǎo)致肝臟游離脂肪酸的大量涌入造成過高的肝臟TG濃度和高TG血癥[21-22]。酮體是脂肪酸在肝臟進行正常分解代謝所生成的特殊中間產(chǎn)物,乙酰乙酸是其代謝產(chǎn)物。正常生理情況下,酮體及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的含量很低[23]。NAFLD病理狀態(tài)下,蓄積的脂肪導(dǎo)致脂動員增強,脂肪酸分解,肝臟中酮體及代謝產(chǎn)物的水平也會增加,甚至還會引起酸中毒[24]。乙酰乙酸也參與丁酸代謝。丁酸代謝上的許多物質(zhì)最終用于生產(chǎn)酮體。此外,辛二酸也是脂肪酸的代謝產(chǎn)物。模型組肝臟乙酰乙酸和辛二酸水平明顯升高,表明模型組肝臟脂肪酸分解代謝加強,酮體的合成和代謝明顯增加。經(jīng)銀耳多糖治療后,乙酰乙酸和辛二酸水平有所降低,表明銀耳多糖可以通過調(diào)節(jié)異常的酮體的合成和代謝,抑制脂肪酸分解,減少肝脂肪蓄積,減輕肝臟的脂肪變性程度。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)在NAFLD發(fā)展和惡化中起關(guān)鍵作用[25]。ROS可以過氧化膜磷脂和蛋白質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重的細胞氧化損傷[26-27]。正常生理條件下,機體ROS和抗氧化劑的水平保持動態(tài)平衡,然而,NAFLD患者體內(nèi)則出現(xiàn)ROS水平升高或抗氧化劑水平降低的情況[28]。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是體內(nèi)清除ROS的重要物質(zhì)之一[29]。甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸是合成GSH的原料。甘氨酸是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝上的重要產(chǎn)物,其水平的降低間接影響GSH的合成和機體的抗氧化能力。D-葡萄糖醛酸是抗壞血酸和醛酸代謝途徑上的物質(zhì)。抗壞血酸和醛酸代謝也是和保肝作用有關(guān)的代謝[30]。模型組甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平降低表明NAFLD大鼠抗氧化能量降低。給予銀耳多糖后,甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平上調(diào),表明銀耳多糖還可以通過調(diào)節(jié)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,抗壞血酸和醛酸代謝水平改善機體的氧化損傷,增加抗氧化能力,發(fā)揮保肝作用。

3 結(jié)論

銀耳多糖可降低NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-c、ALT、AST和ALP水平,增加HDL-c水平,并可降低NAFLD大鼠肝脂肪蓄積,減輕肝臟的脂肪變性程度。其作用機制與調(diào)節(jié)12種生物標(biāo)志物(蘋果酸、山梨醇、甘氨酸、D-葡萄糖醛酸、延胡索酸、D-葡萄糖、檸檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、順-烏頭酸和乙酰乙酸)所對應(yīng)的6條主要代謝通路(酮體的合成和代謝,乙醛和二羧酸代謝,抗壞血酸和醛酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,TCA循環(huán)和丁酸代謝),使其向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變有關(guān),從而緩解NAFLD大鼠代謝紊亂的癥狀,發(fā)揮降脂保肝功效。