響應面法優(yōu)化固相酸水解鮑魚臟器多糖工藝

孫 沖,杜阿珠,姚昱錕,陳錦權(quán),方 婷1,,*

(1.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心,福建福州 350002;2.福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350002)

鮑魚(Haliotisdiscushannai)素以名貴著稱,因其高營養(yǎng)價值,一直深受著消費者喜愛[1],但如今大多數(shù)食品加工廠對鮑魚的加工只局限于對其肉質(zhì)的利用,而占鮑魚重量1/4的鮑魚臟器往往被直接丟棄或做飼料處理[2]。鮑魚臟器被人們稱為“鮑魚肝”,含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、魚油等高活性物質(zhì)及微量元素[3],直接丟棄會造成資源浪費,鮑魚臟器中的重金屬還會造成環(huán)境污染[4]。重金屬含量超標及鮑魚毒素[5]制約鮑魚臟器的利用,因此如何合理地開發(fā)利用鮑魚下腳料,將這些廢棄物變廢為寶,創(chuàng)造出更多的經(jīng)濟效益,受到社會的關注[6]。

已有研究發(fā)現(xiàn)鮑魚臟器中含有豐富的多糖類化合物[7],鮑魚因其長期生存在高鹽、低溫缺氧、光照不足的環(huán)境中,使得鮑魚多糖往往具有獨特的生物活性,如降血脂[8]、抗氧化[9]、抗凝血[10]、抑菌[11]、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)[12]等。但多糖類物質(zhì)一直受限于粘度大、分子量大、不易散、不利于人體吸收利用[13]等缺點,所以其應用范圍變得很狹窄。多糖降解為寡糖后,會發(fā)生分子量降低,結(jié)構(gòu)簡化[14],溶解性增強等變化,同時寡糖較多糖低毒性,因此寡糖一直是研究熱點。寡糖相對分子量小、易于溶解、易被吸收,較其它糖類化合物表現(xiàn)出更為顯著的生物活性,具體表現(xiàn)為抗氧化[15]、抗腫瘤[16]、抗凝血[17]等,因而備受人們的關注,所以確定多糖水解最佳條件就顯得尤為重要。鮑魚臟器寡糖(abalone viscera oligosaccharide,AVO)是由鮑魚臟器多糖(abalone viscera polysaccharide,AVP)降解而來的聚合度較低的低聚糖,目前對鮑魚臟器寡糖的研究少有報道。

本文利用固相酸(732#陽離子交換樹脂)降解多糖,水解條件溫和,且水解過程中不會引入其他雜質(zhì),樹脂可以回收利用,并以多糖水解率為指標,結(jié)合響應面法(response surface methodology,RSM)優(yōu)化多糖水解條件,確定了固相酸水解多糖的最佳工藝條件,同時采用葡聚糖凝膠柱層析和紅外光譜分析對降解產(chǎn)物進行了分離純化[18]和結(jié)構(gòu)測定,以期為鮑魚的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑魚臟器多糖(AVP) 本試驗前期制備并純化[19];硫酸、氫氧化鈉、無水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、苯酚(結(jié)晶酚)、磷酸、牛血清蛋白、濃鹽酸、氯化鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;732#陽離子交換樹脂 武漢華眾新化工有限公司;氯仿 分析純，杭州高晶精細化工有限公司;正丁醇 分析純,浙江杭州雙林化工試劑廠;考馬斯亮藍G-250 分析純,北京恒業(yè)中遠化工有限公司。

LG-1.0真空冷凍干燥機 沈陽航天新陽速凍設備制備有限公司;L-550臺式低速離心機、DD5大容量離心機 長沙湘儀離心機有限公司;JJ600電子天平 常熱市雙杰測試儀器廠;R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;PH SJ-3F pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;UV-6300PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;BT-100電腦恒流泵、SBS-100-LCD自動部分收集器、HD421-88紫外檢測儀 上海琪特分析儀器有限公司;HWS28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;DHG-9240A電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;冰箱 西門子公司;VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀 德國布魯克BRUKER。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑魚臟器多糖水解工藝 稱取質(zhì)量為0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,向其中加入一定質(zhì)量的732#陽離子交換樹脂,在基礎實驗溫度下反應不同的時間。反應完畢后立即用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至中性,離心(7000 r/min,15 min),除去樹脂及水不溶性殘渣,上清液加入無水乙醇,使最終乙醇體積分數(shù)為70%,靜置過夜,離心(7000 r/min,15 min),除去乙醇不溶性殘渣,上清液減壓蒸發(fā)近干,冷凍干燥即得鮑魚寡糖[20]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 樹脂用量對多糖水解率的影響 稱取0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,加入質(zhì)量為10、20、30、40、50、60 g的732#樹脂,按1.2.1中方法在水浴溫度為70 ℃的條件下降解3 h,測定鮑魚臟器多糖水解率。

1.2.2.2 水解時間對多糖水解率的影響 稱取0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,加入質(zhì)量為30 g的732#陽離子交換樹脂,按1.2.1中方法在水浴溫度為70 ℃的條件下降解1、2、3、4、5 h,測定鮑魚臟器多糖水解率。

公司背靠萬達商業(yè)，跨區(qū)域開發(fā)能力突出，兼具高流量和低成本優(yōu)勢。大部分依托于萬達商業(yè)地產(chǎn)，選址風險和租金成本均低于行業(yè)平均。隨著萬達商業(yè)在三四線城市加速下沉，公司有望在三四線市場提高影響力。公司票房市占穩(wěn)定在13-15%，領先的放映技術(shù)和觀影體驗帶來高票價，NOC系統(tǒng)和大數(shù)據(jù)分析助力科學排片，提升上座率。隨著行業(yè)擴張回歸理性、中小院線出清，經(jīng)營效率高的龍頭有望提升盈利能力和市場占有率。

1.2.2.3 水解溫度對多糖水解率的影響 稱取0.1 g鮑魚臟器多糖,加入100 mL蒸餾水,加入質(zhì)量為30 g的732#陽離子交換樹脂,按1.2.1中方法在水浴溫度分別為50、60、70、80、90 ℃的條件下降解3 h,測定鮑魚臟器多糖水解率。

1.2.3 響應面優(yōu)化設計 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,進行響應面試驗。采用Design Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析確定數(shù)學模型。每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼,該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程,因素水平設計見表1。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 還原糖含量測定及水解率計算 本試驗水解后的寡糖混合物中還原糖含量的測定采用DNS法。參考彥繁鶴等對甘蔗中還原糖的測定[21]。測定還原糖的含量后,按下式計算多糖水解率。

1.2.5 寡糖分離 本試驗對所得的鮑魚臟器寡糖進行凝膠層析,選用Sephadex G-25(100 cm×1.5 cm)凝膠層析分離純化鮑魚臟器寡糖,準確稱取一定量的Sephadex G-25,在蒸餾水中進行溶脹,充分溶脹后去除上層懸浮的細小顆粒,把處理好的Sephadex G-25先進行半小時的超聲波清洗器脫氣,保持浸濕狀態(tài),并緩慢倒入層析柱中,待其自然沉降后,用蒸餾水平衡一天。加少量蒸餾水將鮑魚臟器寡糖充分溶解,上層析柱,洗脫劑為蒸餾水,通過恒流泵控制流速為1.0 mL/min,每6 min收集一管,采用苯酚-硫酸法[22]檢測每管在490 nm處的吸收峰,以洗脫管數(shù)為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制洗脫曲線。將收集到鮑魚臟器寡糖組分減壓濃縮后冷凍干燥,得到鮑魚臟器寡糖。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取樣品2 mg,與200 mg的經(jīng)過干燥的KBr放在瑪瑙研缽里,研磨混勻,壓片,用傅里葉變換紅外光譜儀在500～4000 cm-1波長區(qū)域內(nèi)進行紅外掃描[23],從而確定糖苷鍵的構(gòu)型及觀察其他官能團。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 樹脂用量對多糖水解率的影響 圖1為樹脂用量對多糖水解率的影響,由圖1可知,多糖水解率隨樹脂用量先上升再下降,當樹脂用量為40 g時,多糖水解率最高,水解率為77.8%,故最佳樹脂用量為40 g。相比于伍毅等[24]利用鹽酸水解大棗多糖的研究,固相酸水解多糖的水解率變化更加平緩,這表明相比于鹽酸水解多糖,固相酸水解條件更加溫和,且水解過程中不會引入其他雜質(zhì),陽離子樹脂可以回收重復使用,更加綠色環(huán)保。

圖1 樹脂用量對多糖水解率的影響Fig.1 Effect of resin dosage on thehydrolysis rate of polysaccharide

2.1.2 水解時間對多糖水解率的影響 水解時間對鮑魚臟器多糖水解率有一定影響,由圖2可知,在1～3 h時,多糖水解率呈上升趨勢,多糖水解率在50%～80%之間,當時間長于3 h后,多糖水解率趨于平緩,水解率基本保持在76%,不再發(fā)生明顯變化,與牛放等[25對野菊花多糖水解時間的研究一致,表明多糖水解率已經(jīng)達到最大釋放量,故從能源利用效率考慮,水解最適時間為3 h。

圖2 水解時間對多糖水解率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time onhydrolysis rate of polysaccharide

2.1.3 水解溫度對多糖水解率的影響 由圖3可知,隨著水解溫度上升,多糖水解率增加,在70 ℃時,水解率達到最高,為76%。水解溫度是影響鮑魚臟器多糖水解率的一個重要因素,隨著溫度升高,分子運動加劇,多糖糖苷鍵被酸分子破壞的幾率增加,從而可以提高水解率[26],但隨著溫度的繼續(xù)升高多糖水解率開始下降。而野菊花[25]、紫菜[27]、猴頭菇[28]等多糖水解率隨水解溫度上升會趨于平衡,造成這一差異的原因一方面是樹脂達到了其耐受溫度,自身結(jié)構(gòu)遭到破壞,催化降解能力逐漸降低[29];另一方面是水解溫度升高會導致產(chǎn)物中糖發(fā)生復分解反應,生成了糠醛等非糖副產(chǎn)物[30],從而使得還原糖含量下降,引起水解率減小,故最佳水解溫度為70 ℃。

圖3 水解溫度對多糖水解率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperatureon hydrolysis rate of polysaccharide

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面分析因素水平的確定 在單因素實驗的基礎上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合設計原理,以3個主要因素樹脂用量、水解時間和水解溫度為自變量,以3次試驗所得鮑魚臟器多糖水解率的平均值為響應值(Y)設計三因素三水平的響應面分析試驗,具體的設計與結(jié)果如表2。

表2 響應面分析方案與結(jié)果Table 2 RSM analysis scheme and results

2.2.2 響應面試驗結(jié)果 采用Design Expert 8.0.6 軟件進行統(tǒng)計分析,得到回歸方程:Y=80.69+0.61A+1.91B+2.75C-0.66AB+0.027AC-0.81BC-3.15A2-3.31B2-3.30C2

為了體現(xiàn)回歸方程的有效性及各因素對水解率的影響程度,對二次多元回歸方程進行了方差分析,結(jié)果如表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established native regression model

2.2.4 響應曲面分析 響應曲面圖和等高線圖能夠直觀反應出各因素間交互作用的強弱。響應曲面坡度越陡峭,說明各因素間的交互作用越顯著,響應曲面越平緩,說明各因素的交互作用越弱;等高線為橢圓形時,說明各因素間的交互作用越強,等高線越趨近于圓形時,說明各因素間的交互作用較弱。圖4(a)為樹脂用量和水解時間之間交互作用的結(jié)果,當水解溫度一定時,隨著樹脂用量和水解時間的增加,多糖水解率先升高再降低,響應曲面明顯,有明顯的峰值。圖4(b)為樹脂用量和水解溫度之間的交互作用,由圖可知,溫度升高可以增加水解率,但溫度過高會影響樹脂結(jié)構(gòu)和水解產(chǎn)物,多糖水解率下降。圖4(c)為水解時間和水解溫度之間交互作用的效果,從圖中可以看出,多糖水解率隨著兩者的增加先升高再降低,有明顯的最大值。從等高線圖可以直觀看出,各交互項等高線圖近似圓形,說明各因素間交互作用不顯著,與表3中顯著性檢驗結(jié)果相吻合。由響應曲面最高點及等高線圖知,在所選范圍內(nèi)存在峰值即響應曲面最高點,也是等高線圖的中心點。

圖4 各因素交互作用對多糖水解率影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of interactions among different factors on polysaccharide hydrolysis rate

2.2.5 多糖水解率最優(yōu)值的確定及驗證試驗 利用Design Expert 8.0.6 軟件進行分析確定各因素的最優(yōu)值為:樹脂用量A=40.26 g,水解時間B=3.14 h,水解溫度C=70.01 ℃,多糖水解率的預測值Y=80.19%。結(jié)合實際操作將各因素的最佳值修正為樹脂用量40 g,水解時間3 h,水解溫度70 ℃。在此條件下進行3次平行驗證,最終鮑魚臟器多糖水解率為80.69%,接近且略高于預測值,因此,響應面法優(yōu)化鮑魚臟器多糖水解條件是可行的。

目前對鮑魚臟器寡糖制備的研究還少有報道。Wu等[31]通過中心復合設計優(yōu)化利用過氧化氫水解牡蠣多糖制備寡糖,寡糖產(chǎn)量為10.61%;鄧宇峰等[32]采用酶法水解龍須菜瓊膠,多糖水解率為56.6%;和法濤等[28]利用硫酸酸解猴頭菇多糖并通過正交試驗優(yōu)化,多糖水解率為70.11%。本實驗通過響應面法優(yōu)化鮑魚臟器多糖水解條件,相比于其它多糖,鮑魚臟器多糖水解率為80.69%,水解率較高,具有一定的實際應用前景和價值。

2.3 鮑魚臟器寡糖的分離純化

采用Sephadex G-25 凝膠柱對鮑魚臟器寡糖混合物進行分子量分級,鮑魚臟器寡糖混合物在凝膠柱上的洗脫曲線如圖5所示。曲線在第13管和第29管出現(xiàn)兩個洗脫峰,第13管的洗脫峰尤為明顯,表明鮑魚臟器寡糖混合物中以這兩個組分為主,且第13管的組分占絕大部分。收集第13管的鮑魚臟器寡糖組分,合并洗脫液,減壓濃縮,冷凍干燥,得鮑魚臟器寡糖產(chǎn)物。

圖5 寡糖混合物的洗脫曲線Fig.5 Elution curve of oligosaccharide mixture

2.4 鮑魚臟器寡糖的紅外光譜分析

圖6 AVO紅外吸收光譜Fig.6 The infrared absorption spectrum of AVO

3 結(jié)論

利用固相酸水解鮑魚臟器多糖制備寡糖,通過單因素實驗研究了樹脂用量、水解時間和水解溫度對鮑魚臟器多糖水解率的影響,并用響應面法對鮑魚臟器多糖水解工藝進行優(yōu)化,得到最佳水解條件為:樹脂用量40 g,水解時間3 h,水解溫度70 ℃。在該條件下進行3次平行試驗,得到鮑魚臟器多糖水解率為80.69%,接近且略高于預測值,表明對鮑魚臟器多糖水解工藝的優(yōu)化是可行的,為鮑魚臟器的開發(fā)利用提供了參考,最后使用葡聚糖凝膠柱層析和紅外光譜分析對降解產(chǎn)物進行了分離純化和結(jié)構(gòu)測定,表明鮑魚臟器寡糖含有吡喃環(huán),為α-型糖。