云南小?？Х裙ぶ泄z的提取及其水解物抑菌活性研究

李曉嬌,付文相,楊麗華,侯洪波,宋志姣

(保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院,云南保山 678000)

咖啡屬茜草科(Rubiaceae)咖啡屬(Coffea)多年生常綠灌木或小喬木,原產(chǎn)于非洲埃塞俄比亞,其中以小粒種(Coffeaarabica)、中粒種(C.canephora)和大粒種(C.liberica)咖啡栽培較多[1]。我國(guó)的咖啡主產(chǎn)區(qū)在云南,其中小?？Х鹊漠a(chǎn)量占全國(guó)98.80%,因其獨(dú)特的氣候條件,所產(chǎn)的小?？Х绕焚|(zhì)優(yōu)異,云南省中以普洱市、保山市、臨滄市和德宏州為主要種植區(qū)[2]?？Х燃庸み^(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的咖啡果皮[3],Emaille等[4]和Saenger等[5]的研究報(bào)道表明,干法加工每生產(chǎn)1 t咖啡豆,大約會(huì)產(chǎn)生1 t的咖啡果皮,而在濕法加工產(chǎn)生咖啡果皮的量可達(dá)到2 t以上。大量的咖啡果皮通常會(huì)被丟棄,或用作堆肥,不僅資源浪費(fèi),而且在一定程度上污染環(huán)境[6]。

果膠是由α-1,4糖苷鍵連接半乳糖醛酸與鼠李糖、阿拉伯糖等中性糖聚合而成的雜多糖,主要是由原果膠、果膠酯酸和果膠酸組成[7],具有良好的生理和藥理活性,如抑癌、降糖、降脂和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用[8-9]。果膠經(jīng)果膠酶降解成的低聚物具有明顯的抑菌活性,可作為一種新型的天然抑菌劑[10-11],柚皮果膠的水解和抑菌研究結(jié)果表明,其對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌和殺菌效果[12]。常見(jiàn)的果膠提取方法主要有酸法、超聲波、微波輔助法、堿法、酶法、鹽提法和離子交換法等[13]。其中酸法是工業(yè)中使用最廣泛的果膠提取方法,其優(yōu)點(diǎn)是成本較低,得率穩(wěn)定,反應(yīng)條件容易控制。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)小粒咖啡果渣資源利用的研究主要集中在提取咖啡因、土壤調(diào)節(jié)劑、作為燃料、飼料、重金屬的生物吸附劑和硬質(zhì)纖維板的原料等方面[14-17],而從小?？Х裙ぶ刑崛」z還未見(jiàn)報(bào)道。市場(chǎng)上的商品果膠主要提取自檸檬、蘋(píng)果、柑桔,對(duì)小粒咖啡果皮果膠的提取研究還比較少,也無(wú)小?？Х裙すz水解物的抑菌活性研究的相關(guān)報(bào)道。

考慮到提取成本,以及后期果膠的中試生產(chǎn)的研究,本文采用酸法對(duì)小?？Х裙すz進(jìn)行提取。以云南保山小?？Х裙樵?以果膠得率為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化小?？Х裙すz的提取工藝,并測(cè)定其半乳糖醛酸含量、干燥失重、總灰分、pH、酯化度等理化性質(zhì)及對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用,以期為小?？Х裙すz的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小?？Х裙?云南保山老基地咖啡有限公司提供;無(wú)水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸 均為分析純,重慶川東化工有限公司;半乳糖醛酸、咔唑、檸檬酸 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鈉 分析純,成都化學(xué)試劑廠(chǎng);果膠酶(酶活力≥500000 U/g)成都科隆化學(xué)品有限公司;牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;氯化鈉 分析純,南匯彭鎮(zhèn)營(yíng)房化工廠(chǎng);瓊脂條 福建省石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司;商品果膠 進(jìn)口分裝,Sigma;供試菌種:大腸桿菌Escherichiacoli(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922)、金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC259226538)、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6633) 均購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

UV5100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;FE20 pH酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;NDJ-85旋轉(zhuǎn)粘度計(jì) 上海昌吉質(zhì)地儀器有限公司;HZQ-X100A恒溫培養(yǎng)振蕩器、DZF-602真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LDZX--75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小?？Х裙ゎA(yù)處理 小?？Х裙?濕法加工),60 ℃下烘干至恒重后粉碎,過(guò)20目篩,于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小?？Х裙ぶ泄z的提取與鑒別

1.2.2.1 小?？Х裙ぶ泄z的提取 稱(chēng)取10.00 g粉碎后的小?？Х裙び?50 mL錐形瓶中,加適量蒸餾水,在90～100 ℃下煮沸5 min。趁熱過(guò)濾,濾渣用80%的乙醇洗滌3次,每次洗滌5 min(除去色素、糖酸等),洗滌完后于80 ℃烘箱中烘干。然后置于250 mL錐形瓶中,按一定料液比加入一定濃度的稀鹽酸溶液,在50 ℃下提取60 min,提取結(jié)束后冷卻、抽濾,濾液濃縮至50 mL,快速用冰水冷卻后加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇析,減壓過(guò)濾,濾出物用一倍量的75%酒精洗滌,除去醇溶性雜質(zhì)。4000 r/min離心5 min分離,濾渣于40 ℃下真空干燥至恒重,得果膠固體,稱(chēng)重計(jì)算得率。

1.2.2.2 果膠的鑒別實(shí)驗(yàn) 根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 25533-2010方法對(duì)所提取的小?？Х裙すz做驗(yàn)證試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g小?？Х裙すz,加入40 mL蒸餾水,不斷攪拌,看是否形成凝膠或稠狀液體。用移液管移取5 mL該粘稠狀溶液于25 mL試管中,加入1 mL氫氧化鈉(1.25 mol/L)溶液,靜置20 min,看是否出現(xiàn)半透明或不透明的凝膠沉淀。同時(shí)測(cè)定小?？Х裙すz的紅外光譜,并與商品標(biāo)準(zhǔn)果膠的紅外光譜進(jìn)行對(duì)比分析,鑒別提取物。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 料液比對(duì)果膠得率的影響 在提取溫度50 ℃、提取時(shí)間為60 min、提取液pH為1.5的條件下,考察不同料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)對(duì)果膠得率的影響。

1.2.3.2 提取液pH對(duì)果膠得率的影響 在料液比1∶25 g/mL、提取溫度為50 ℃、提時(shí)間為60 min的條件下,考察提取液不同pH(1.0、1.5、2.0、2.5、3)對(duì)果膠得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)果膠得率的影響 在料液比1∶25 g/mL、提取時(shí)間為60 min、提取液pH為1.5的條件下,考察不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)果膠得率的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響 在料液比1∶25 g/mL、提取溫度為50 ℃、提取液pH為1.5的條件下,考察不同提取時(shí)間(40、60、80、100、120 min)對(duì)果膠得率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以半乳糖醛酸含量為指標(biāo),選取料液比(A)、提取液pH(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)四個(gè)單因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 果膠得率計(jì)算 采用重量法[18]測(cè)定小?？Х裙すz得率。

果膠得率(%)=m/m0×100

式中:m為提取的小?？Х裙すz質(zhì)量,g;m0為小?？Х裙べ|(zhì)量,g。

1.2.6 小?？Х裙すz理化性質(zhì)的測(cè)定 小?？Х裙すz的理化性質(zhì)測(cè)定參照GB 5009.3-2016(干燥失重)、GB 25533-2010(酯化度、感官指標(biāo))、GB 5009.4-2016(灰分測(cè)定)、半乳糖醛酸含量采用采用咔唑硫酸法[19],pH、酸不溶灰分等理化指標(biāo)檢測(cè)均按果膠國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2484-2000來(lái)進(jìn)行。

1.2.7 小粒咖啡果皮果膠熱穩(wěn)定性的測(cè)定 按1.2.2的方法,提取條件為:料液比為1∶30 g/mL,pH1.5,提取溫度70 ℃,提取時(shí)間100 min,提取小?？Х裙すz,并配制100 mL 1%的果膠溶液,置于95 ℃的烘箱內(nèi),分別干燥0、2、4、6、8、10 min后取出樣品,冷卻至室溫后,測(cè)定其相對(duì)粘度[20-21]。

1.2.8 培養(yǎng)基制作及菌種活化培養(yǎng)

1.2.8.1 固體培養(yǎng)基 稱(chēng)取牛肉膏6.0 g、蛋白胨20.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂30.0～40.0 g配置2000 mL pH7.4～7.6的培養(yǎng)基。121 ℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌30 min。滅菌后于超凈工作臺(tái)中向培養(yǎng)皿中倒入約25 mL培養(yǎng)基,冷卻后倒置培養(yǎng)皿,備用。

1.2.8.2 液體培養(yǎng)基 稱(chēng)取牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、氯化鈉1.5 g以蒸餾水配置300 mL pH7.4～7.6的液體培養(yǎng)基。分三份加入三個(gè)錐形瓶中,121 ℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌30 min,備用。

1.2.8.3 菌種活化培養(yǎng) 菌種活化:無(wú)菌環(huán)境,接種環(huán)劃線(xiàn)將供試菌種接種于固體培養(yǎng)基內(nèi),37 ℃培養(yǎng)72 h。菌種培養(yǎng):配制液體培養(yǎng)基,高壓滅菌處理冷卻后接種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌,放置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h,使菌種濃度達(dá)到106～107CFU/mL,即紫外分光光度計(jì)最大吸收波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度在1.4～1.5左右。若吸光度低于1.4,則繼續(xù)培養(yǎng)至適宜濃度。若吸光度大于1.5,則需加適量無(wú)菌生理鹽水稀釋[22]。

1.2.9 小?？Х裙すz水解物抑菌活性測(cè)定

1.2.9.1 不同水解時(shí)間果膠水解物的制備 配制0.2 mol/L磷酸氫二鈉500 mL,0.1 mol/L檸檬酸溶液500 mL,并制備磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.4)。稱(chēng)取8.0 g果膠,緩沖液溶解并定容至500 mL,得果膠液。加入0.8 g果膠酶于500 mL果膠液中,混勻后將該混合液置于50 ℃水浴中進(jìn)行水解,分別于反應(yīng)0、30、60、90、120、150、180、210、240 min時(shí)取樣50 ml,迅速將其于沸水中加熱10 min滅酶,冷卻后3500 r/min離心5 min,將上清液濃縮至原體積的1/2,冷藏備用[23]。

1.2.9.2 不同水解時(shí)間果膠水解物抑菌效果采用濾紙片法[24],測(cè)定抑菌圈大小,表征抑菌效果。于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),移取150 μL濃度為106～107CFU/mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液,均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。取6 mm濾紙片三片,分別移取5 μL不同水解時(shí)間的果膠水解物滴于濾紙片上均勻潤(rùn)濕,平鋪于培養(yǎng)基上,放于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h并做空白對(duì)照。觀(guān)察有無(wú)抑菌圈,用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次,比較抑菌效果,通過(guò)抑菌圈大小確定最佳水解時(shí)間。

1.2.9.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定具有最大抑菌圈直徑水解物的MIC和MBC。第1～7管的樣品質(zhì)量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5 g/L。吸取1 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液(106～107CFU/mL),將各試管置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度為其MIC。分別從樣品濃度不低于MIC的各試管中取1 mL培養(yǎng)液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,涂布均勻后于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。以仍無(wú)菌生長(zhǎng)或菌落總數(shù)小于5的濃度為樣品的MBC,同時(shí)以相同濃度的山梨酸鉀作對(duì)照實(shí)驗(yàn)[17]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.5軟件作圖,SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小?？Х裙すz的鑒別實(shí)驗(yàn)

2.1.1 表觀(guān)特征鑒別實(shí)驗(yàn) 小?？Х裙すz中加蒸餾水得到粘稠狀液體,然后加氫氧化鈉出現(xiàn)了半透明的凝膠沉淀。該鑒別實(shí)驗(yàn)說(shuō)明小?？Х裙すz符合果膠的表觀(guān)特征。

2.1.2 小?？Х裙z的紅外光譜分析 小?？Х裙すz的紅外光譜如圖1所示,小?？Х裙すz在3580～3100 cm-1出現(xiàn)一個(gè)來(lái)自-OH伸縮振動(dòng)的寬峰,該區(qū)域的形成主要是由于分子間和分子內(nèi)半乳糖醛酸聚合物的氫鍵作用[25]。在2920 cm-1附近出現(xiàn)的尖銳的吸收峰是烷基的伸縮振動(dòng),1732和1261 cm-1是酯化的羧基(-COOR)和羧基(COO-)中羰基的吸收峰,1048 cm-1是糖苷鍵(C-O-C)的彎曲振動(dòng)峰,1200～1000 cm-1的強(qiáng)吸收峰是果膠分子的指紋區(qū),對(duì)比商品果膠的紅外光譜圖[26],兩者紅外光譜圖相似,并結(jié)合果膠表觀(guān)特征和表4中半乳糖醛酸的含量已達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),可以確定小?？Х裙ぬ崛∥餅楣z。

表4 云南小?？Х裙すz的理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical property of pectin from Coffea arabica pericarp

圖1 小粒咖啡果皮果膠紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectroscopy of pectinfrom Coffea arabica pericarp

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)得率的影響 由圖2可見(jiàn),隨著提取劑用量的增大,果膠得率先增加后下降。當(dāng)料液比為1∶15和1∶20 g/mL時(shí),果膠得率較低,可能因?yàn)槿軇┝可?使得物料粘度大,且濃度梯度小,擴(kuò)散速度慢,原料中的果膠難以大量轉(zhuǎn)移到提取液中,使得提取不完全,產(chǎn)率低且過(guò)濾困難[27]。當(dāng)料液比為1∶30 g/mL時(shí)果膠得率最高為10.05%。繼續(xù)增加提取劑用量,則醇析消耗的乙醇量增大,濃縮時(shí)間增長(zhǎng)、能耗增加,考慮到成本和后續(xù)濃縮環(huán)節(jié)[28],料液比應(yīng)控制在1∶30 g/mL為宜。通過(guò)單因素方差分析,當(dāng)料液比范圍在1∶15～1∶20 g/mL和1∶25～1∶35 g/mL時(shí),料液比對(duì)果膠得率影響不顯著(P>0.05),但兩段料液比對(duì)果膠得率存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 料液比對(duì)果膠得率的影響Fig.2 The effect of material liquid ratioon extraction rate of pectin注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖3～圖5同。

2.2.2 提取液pH對(duì)得率的影響 由圖3可知,隨著pH的升高,果膠得率先增加后降低。當(dāng)提取液pH為1時(shí),果膠得率較低,這可能是因?yàn)楫?dāng)提取液的pH過(guò)低時(shí),提取液的極性較強(qiáng),果膠分子的甙鍵和酯鍵斷裂,果膠會(huì)發(fā)生解聚[29],且pH越低,溶液顏色越趨于紅褐色,影響果膠產(chǎn)品顏色。當(dāng)提取液pH為1.5時(shí),果膠會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性果膠,果膠得率最高為9.56%。當(dāng)pH進(jìn)一步增加時(shí),果膠可能會(huì)轉(zhuǎn)化為果膠酸[30],得率降低。因此,選擇提取液pH為1.5為宜。通過(guò)單因素方差分析,除pH為1.0和2.0、2.5和3.0時(shí)果膠得率差異不顯著(P>0.05),其余不同pH下果膠得率均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 提取液pH對(duì)果膠得率的影響Fig.3 The effect of pH on extraction rate of pectin

2.2.3 提取溫度對(duì)得率的影響 由圖4可知,隨著提取溫度的上升,果膠得率也迅速增加,當(dāng)提取溫度達(dá)到50 ℃,得率最高為10.18%,顯著高于其它提取溫度(P<0.05)。由于原果膠水解為水溶性果膠需要在一定的溫度下才能進(jìn)行,溫度太低,只有部分原果膠轉(zhuǎn)化為果膠,水解不完全,得率較低。當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí),由于果膠的耐熱性較差,會(huì)使生成的果膠因?yàn)樗獬潭葎×叶M(jìn)一步降解成果膠酸,導(dǎo)致得率下降[30]。因此,選擇提取溫度50 ℃為宜。

圖4 提取溫度對(duì)果膠得率的影響Fig.4 The effect of temperature on extraction rate of pectin

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 由圖5可知,果膠得率隨提取時(shí)間的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。提取時(shí)間為100 min時(shí),果膠得率最高為12.75%,顯著高于其它提取時(shí)間(P<0.05),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),小?？Х裙ぶ械墓z得到充分水解,果膠得率也迅速升高。當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),則會(huì)造成果膠分子鏈發(fā)生熱降解反應(yīng),致使果膠產(chǎn)率下降,且在酸性條件下放置太長(zhǎng)時(shí)間也會(huì)造成酸性降解[31-32],所以100 min是最適宜提取時(shí)間。考慮到提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),耗能增多,果膠在酸性溶液中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)部分分解,所以選擇60、80、100 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on extraction rate of pectin

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。采用酸法提取小粒咖啡果皮中的果膠,對(duì)得率影響的大小順序?yàn)?提取溫度(C)>提取液pH(B)>提取時(shí)間(D)>料液比(A),最佳提取工藝為:A2B2C3D3,即料液比為1∶30 g/mL,pH為1.5,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間為100 min。并在該工藝條件下,進(jìn)行3組平行試驗(yàn),果膠的平均得率為15.13%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3表明,提取溫度(C)、提取液pH(B)和提取時(shí)間(D)對(duì)小?？Х裙すz的得率影響極顯著(P<0.01)，而料液比(A)對(duì)小?？Х裙すz的得率影響顯著(P<0.05)。因素對(duì)得率影響的大小順序?yàn)椋篊>B>D>A，與極差分析結(jié)果一致。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.4 小?？Х裙すz理化性質(zhì)

如表4所示,通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn),小粒咖啡果皮果膠中半乳糖醛酸的含量為67.71%,均符合GB 25533-2010和QB-2482-2000標(biāo)準(zhǔn)要求。干燥失重為10.17%、總灰分22.75%、pH2.61均達(dá)到GB 25533-2010和QB-2482-2000相應(yīng)的要求。酯化度在50%～75%的范圍內(nèi),屬于高酯果膠。酸不溶性灰分為1.57%,超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍(≤1),由于小粒咖啡果皮果膠為天然提取物,因此無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素含量相對(duì)較高。

2.5 小?？Х裙すz熱穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)在60 ℃下提取小?？Х裙ぶ械墓z,其半乳糖醛酸的含量為67.71%,達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),可見(jiàn)在60 ℃下小粒咖啡果皮果膠是穩(wěn)定的,但由于醇析后需要對(duì)果膠進(jìn)行干燥處理,因此需考慮干燥時(shí)間對(duì)果膠穩(wěn)定性的影響。由圖6可知,隨著干燥時(shí)間的增加,小?？Х裙すz粘度呈下降趨勢(shì)。在干燥初始的0～4 min內(nèi),咖啡果膠粘度極速下降,在4 min后下降趨勢(shì)稍緩,這可能是由于在干燥初始時(shí),果膠鏈間原本存在的交聯(lián)作用而產(chǎn)生的聚合物被熱力作用迅速破壞,故而使其粘度下降明顯。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(4～10 min),因?yàn)楣z分子內(nèi)部的作用力早已破壞,其粘度下降趨勢(shì)較為緩慢[33]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用了真空干燥(40 ℃)小?？Х裙すz,以確保在干燥過(guò)程中果膠的穩(wěn)定性。

圖6 干燥時(shí)間對(duì)咖啡果皮果膠粘度的影響Fig.6 The effect of drying timeon pectin viscosity of coffee pericarp

2.6 小?？Х裙すz水解物抑菌活性

2.6.1 不同水解時(shí)間對(duì)果膠水解物抑菌活性的影響 如表5所示,在咖啡果皮果膠未水解時(shí),就有一定的抑菌活性,在0～180 min內(nèi),果膠水解物的抑菌效果隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高,進(jìn)一步延長(zhǎng)水解時(shí)間,果膠水解物的抑菌活性開(kāi)始降低。這可能是因?yàn)橐欢l件下,大分子的果膠水解生成小分子低聚半乳糖醛酸,低聚半乳糖醛酸具有抗菌作用,但隨著水解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),低聚半乳糖醛酸水解生成D-半乳糖醛酸,寧恩創(chuàng)等[16]、馬慶一等[15]、李學(xué)紅等[23]也發(fā)現(xiàn)果膠的酶解最終產(chǎn)物和酸解產(chǎn)物均無(wú)抑菌活性,因此隨著水解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),抑菌活性降低,故抑制大腸桿菌、草芽孢桿菌、黃色葡萄球菌的最佳水解時(shí)間分別為180、150、150 min。在最佳水解時(shí)間下水解咖啡果皮果膠,測(cè)定其對(duì)三種菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。

表5 不同水解時(shí)間對(duì)咖啡果皮果膠水解物抑菌活性影響Table 5 Effect of different hydrolysis time on bacteriostaticactivity of pectin hydrolysate from coffee pericarp

2.6.2 果膠水解物的最低抑菌濃度(MIC) 表6所示,咖啡果皮果膠水解物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為8、4、8 g/L,而對(duì)照山梨酸鉀對(duì)三種菌的MIC分別為:2、4、4 g/L,可見(jiàn),咖啡果皮果膠水解物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性不如山梨酸鉀,但對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性與山梨酸鉀相當(dāng)。

表6 咖啡果皮果膠水解物對(duì)三種菌的MICTable 6 MIC of pectin hydrolysatefrom coffee pericarp to three bacterias

2.6.3 果膠水解物的最低殺菌濃度(MBC) 如表7所示,小?？Х裙すz水解物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MBC分別為16、8、16 g/L。對(duì)照組山梨酸鉀為4、8、8 g/L。結(jié)果表明,在濃度較高時(shí)果膠的水解物對(duì)三種供試菌具有殺菌作用,且對(duì)枯草芽孢桿菌的殺菌作用與山梨酸鉀相當(dāng),但對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用低于山梨酸鉀。

表7 咖啡果皮果膠水解物對(duì)三種菌的MBC Table 7 MBC of pectin hydrolysatefrom coffee pericarp to three bacterias

3 結(jié)論

首次從云南小?？Х裙ぶ刑崛」z,采用單因素正交試驗(yàn)優(yōu)化得到果膠的最佳提取工藝為:料液比1∶30 g/mL,pH為1.5,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間為100 min,在此工藝條件下咖啡果皮果膠的得率為15.13%。采用果膠酶對(duì)小?？Х裙すz進(jìn)行水解,考察果膠水解物的抑菌效果,結(jié)果表明,小粒咖啡果皮果膠水解物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌活性。其中,果膠水解物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為:8 g/L,MBC均為:16 g/L,比山梨酸鉀的活性弱。而果膠水解物對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC和MBC分別為:4、8 g/L,抑菌活性和山梨酸鉀相當(dāng)。該提取方法相對(duì)簡(jiǎn)單,能耗較小,適合于鄉(xiāng)鎮(zhèn)咖啡果皮廢料提取果膠,并且提取的咖啡果皮果膠理化性質(zhì)符合果膠標(biāo)準(zhǔn),有較好的抑菌活性,可開(kāi)發(fā)成為一種新的天然食品防腐劑,為云南小?？Х裙さ母咧祷C合加工利用提供了新途徑。