溫度敏感型淀粉基聚合物載體的制備、表征及性能分析

寇宗亮,關(guān) 欣,藍(lán)麗紅,張金彥,李湘靜,黃思穎,藍(lán) 平

(廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西多糖材料及改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006)

淀粉是一種天然多糖,具有無(wú)毒性、相容性良好、非免疫原性和低抗原性等特點(diǎn)[1-3],作為一種無(wú)毒和生物可降解的聚合物材料已被廣泛地用于制備生物納米載體[4]。其有大量可被修飾的官能團(tuán),當(dāng)釋放功能性物質(zhì)后可降解為寡糖且易吸收,不會(huì)導(dǎo)致炎癥發(fā)生[5]。由于天然淀粉存在水溶性差、糊化液易老化[6]等缺點(diǎn),使其應(yīng)用受到限制。

為了拓寬木薯淀粉的應(yīng)用范圍,研究者們通過(guò)物理[7-8]、化學(xué)、生物[9]等改性方法對(duì)淀粉進(jìn)行功能化修飾,使其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥[10-11]、化工等各個(gè)領(lǐng)域。由于化學(xué)改性可以通過(guò)在淀粉分子的羥基上引入功能性基團(tuán)使其獲得其他功能特性,近年來(lái)受到人們的追捧[12]。通過(guò)淀粉分子上的羥基與其他基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng),可以制備各種功能性物質(zhì)載體[13-14]。然而在食品包裝部和各種抗性食品的應(yīng)用中,多為玉米淀粉[15],木薯淀粉的應(yīng)用較為鮮見。

膠束作為功能性載體的一種,近年來(lái)因體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性好,常被用作傳遞介質(zhì),受到的關(guān)注程度越來(lái)越高[16]。兩親性聚合物的親水片段和疏水片段在濃度較低時(shí),聚合物分子以單分子的形式存在;當(dāng)聚合物濃度達(dá)到某一數(shù)值后,聚合物分子能夠自組裝形成聚合物膠束[17-18]。

為了改善木薯淀粉諸多缺點(diǎn)限制,拓寬其在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,本研究利用木薯淀粉作為基材,首先以異丙基縮水甘油醚作為溫度敏感的疏水基團(tuán),接枝于淀粉分子骨架上將淀粉分子功能化。然后接枝生物相容性的聚乙二醇(mPEG)作為親水基團(tuán)。利用傅里葉紅外變換光譜(FTIR)、核磁共振(1H-NMR)對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,驗(yàn)證木薯淀粉基聚合物是否成功合成。然后利用透射電鏡(TEM)、熒光分子探針和馬爾文激光納米粒度散射儀對(duì)其形貌和粒徑進(jìn)行表征。最后以姜黃素作為藥物模型,進(jìn)一步探究其在不同溫度環(huán)境中的釋放行為。為制備新型溫度敏感型淀粉基膠束提供了理論依據(jù),進(jìn)一步拓寬了木薯淀粉的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 工業(yè)級(jí),廣西武鳴安寧淀粉有限公司;聚乙二醇(PEG,Mn=4000) 分析純,廣東光華化學(xué)廠有限公司;羧基封端聚乙二醇 根據(jù)參考文獻(xiàn)步驟合成[20];丁二酸酐(SA) 分析純,阿拉丁;姜黃素、N-(3-二甲基氨丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP) 分析純,麥克林。

DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR) 美國(guó)Thermo 公司;Cary100紫外-可見分光光度計(jì) Agilent Technologies;冷凍干燥機(jī) 埃朗科技國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;600 MHZ核磁共振波譜儀(1H-NMR)、透射電子顯微鏡(TEM) Hitachi日立;F-7000熒光分光光度計(jì) 日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 疏水淀粉(St-R)的制備 首先對(duì)木薯淀粉進(jìn)行降解處理[19],將原淀粉25 g,無(wú)水甲醇100 mL加入三口瓶中,然后滴加濃鹽酸4 mL,0.5 h后,加熱至50 ℃反應(yīng)5 h,冷卻至室溫后,先用碳酸鈉進(jìn)行中和,然后抽濾,用甲醇洗滌,干燥備用。

疏水化處理參照楊錦東[19]的方法,在裝有10 mL去離子水的三口瓶中加入5 g降解淀粉,攪拌條件下加入0.5 g的氫氧化鈉,隨后升溫至70 ℃,堿化反應(yīng)1 h。然后緩慢滴加12 g疏水醚化劑,繼續(xù)反應(yīng)5 h。待反應(yīng)結(jié)束后,冷卻到室溫,并用冰醋酸中和至中性,過(guò)濾。產(chǎn)物用50%丙酮反復(fù)洗滌數(shù)次,將析出的產(chǎn)品干燥后稱重保存以備后用。

1.2.2 疏水淀粉(St-R)接枝聚乙二醇共聚物的制備(R-St-mPEG)

1.2.2.1 羧基封端聚乙二醇的制備 參照文獻(xiàn)[20]中的方法,稱取3.8 g聚乙二醇(mPEG)、0.6 g丁二酸酐(SA)和0.01 g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100 mL 的二氯甲烷中,在25 ℃下攪拌48 h。旋蒸除去大量的二氯甲烷之后,反應(yīng)物用四氫呋喃溶解,然后用乙醚在分液漏斗中多次洗滌、沉降。最后真空干燥,得到羧基封端的聚合物mPEG-COOH。

1.2.2.2 疏水淀粉接枝聚乙二醇接枝的制備 參照文獻(xiàn)方法[21],將1 g疏水淀粉(St-R)和9.4 g羧基封端的聚乙二醇溶解在裝有60 mL二甲亞砜(DMSO)溶劑的反應(yīng)瓶中,在攪拌的條件下加入N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亞胺(EDC)0.72 g和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)0.023 g,反應(yīng)在常溫下反應(yīng)。隨后,溶劑和未反應(yīng)的反應(yīng)物通過(guò)透析除去。然后將溶液過(guò)濾,冷凍干燥即得烷基淀粉接枝聚乙二醇共聚物R-St-mPEG。

1.2.3 膠束溶液的制備 取1.2.2.2制備的聚合物100 mg于裝有100 mL PBS緩沖溶液的100 mL容量瓶中,室溫振搖48 h,100 W超聲10 min,使得聚合物在水溶液中充分分散。0.45 μm濾膜過(guò)濾,得澄清的膠束溶液。

1.2.4 測(cè)試及表征

1.2.4.1 傅里葉紅外變換光譜分析 取1～2 mg干燥的聚合物樣品,與50～100 mg干燥的KBr粉末混合,置于瑪瑙研缽中充分研磨,將研磨好的混合物粉末放入壓模中,在10 kPa的壓力下壓制成透明薄片,然后小心地將壓片取出,放入紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試,4000～5000 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.2.4.2 核磁共振分析 稱取30～50 mg的聚合物,用DMSO-d6為溶劑在樣品管中溶解,為了使得樣品充分溶解,用超聲清洗器在100 W的功率條件下超聲10 min。最后將溶解好的樣品裝入核磁管,在室溫下檢測(cè)聚合物的氫譜。

1.2.4.3 臨界膠束濃度(CMC)測(cè)定 臨界膠束濃度的測(cè)定采用芘的熒光探針法分析。熒光探針芘標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制(6×10-6mol/L):用分析天平準(zhǔn)確地稱取芘0.0012 g,燒杯中用適量丙酮溶解后轉(zhuǎn)入1 L容量瓶中,用丙酮定容并搖勻,配制得到濃度為6×10-6mol/L的芘丙酮貯備溶液,使用時(shí)在膠束水溶液中保持6×10-7mol/L的最終濃度。

膠束系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:分別取1 mL配制的芘丙酮溶液于幾個(gè)燒瓶中,讓其完全揮發(fā)備用。再稱取100 mg凍干材料粉末兩份分別于100 mL容量瓶中,加不同pH緩沖溶液溶解定容,取不同量上述膠束溶液進(jìn)行稀釋,配制成1～1×10-4mol/L不同濃度系列的膠束溶液。將不同濃度的膠束水溶液分別取10 mL,分別加入上述含芘的燒瓶中。

1.2.4.4 透射電鏡觀察 取1.2.3制備的膠束溶液滴于鋪有三百目銅篩的碳膜上,用濾紙除去多余水分,在自然條件下干燥,然后用加速電壓為80 kV掃描。

1.2.4.5 粒徑表征 采用激光納米粒度分析儀測(cè)定,用PBS緩沖溶液制備濃度為1.0 mg/mL的膠束溶液,取適量樣品加入比色皿中,參數(shù)設(shè)置為檢測(cè)器位置:173 °,溫度:25 ℃,淀粉折射率:1.53,緩沖溶液折射率:1.33。

1.2.5 負(fù)載性能的探究

1.2.5.1 負(fù)載膠束的制備 精確稱取25 mg姜黃素,將其置于燒杯中,用DMSO溶解后,將姜黃素的DMSO溶液移到250 mL容量瓶中,再用DMSO進(jìn)行定容,得到100 μg/mL的儲(chǔ)備液。精密移取2、3、4、5、6 mL 100 μg/mL的儲(chǔ)備液,將其分別移到100 mL的容量瓶中,用DMSO進(jìn)行定容,即制成2～6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用DMSO做空白對(duì)照液,分別在427 nm處測(cè)定其吸光度。W濃度(C,μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制姜黃素在DMSO中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取8～16 mg姜黃素溶于4 mL DMSO,另稱取100 mg 聚合物,溶于6 mL DMSO中,磁力攪拌使其完全溶解;在劇烈攪拌下,將4 mL姜黃素DMSO溶液緩慢滴入聚合物溶液中,室溫避光攪拌5 min,混合均勻,將混勻后液體轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)(透析膜截留分子量為3500 Da),對(duì)蒸餾水透析24 h,開始每隔12 h換水1次除去有機(jī)溶劑,5000 r/min離心除去藥物沉淀,得上清液,即為載姜黃素納米膠束。選取不同總投藥量(8、10、12、14、16 mg),固定材料每次用量為100 mg,以考察最大負(fù)載量。

式(1)

1.2.5.2 溫度響應(yīng)條件的研究 精確稱取25 mg姜黃素,用PBS緩沖液溶解,轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中,用PBS緩沖液定容,即得到100 μg/mL的藥物溶液,精密移取2、3、4、5、6 mL的藥物溶液到100 mL容量瓶定容,即制得濃度為2～6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用PBS做空白對(duì)照液,427 nm處測(cè)定吸收波長(zhǎng)。繪制得到姜黃素在PBS中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取一定量的負(fù)載膠束,將其溶解在不同溫度的PBS緩沖溶液中(含0.5%吐溫80),使其濃度為1 mg/mL。量取5 mL的上述膠束溶液,裝入預(yù)先處理好的透析袋,再放置于30 mL的PBS緩沖溶液中,分別于25、37 ℃下恒溫振蕩(120 r/min)。間隔多次取樣,每次取樣4 mL,然后再補(bǔ)充4 mL新鮮的PBS緩沖溶液。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定427 nm處的吸收波長(zhǎng),再根據(jù)姜黃素在PBS緩沖溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素在不同時(shí)間下的釋放量。累計(jì)釋放量可根據(jù)式(2)計(jì)算:

式(2)

式中,Cn:第n次取樣時(shí)的濃度;Cn-1:第n-1次取樣時(shí)的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均采用三組平行試驗(yàn)得出平均值,采用Excel 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與處理,并用軟件Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物(R-St-mPEG)的制備

木薯淀粉作為天然淀粉的一種,溶解性也相對(duì)較差,所以在制備木薯淀粉基聚合物膠束時(shí),選用二甲基亞砜作為反應(yīng)溶劑。由木薯淀粉制備聚合物膠束,為避免多基團(tuán)之間的相互反應(yīng),首先需要在淀粉分子骨架上引入疏水性基團(tuán)。異丙基縮水甘油醚不僅是良好的疏水化試劑,同時(shí)也是溫度敏感性的功能基團(tuán),可以使得聚合物形成疏水性內(nèi)核的同時(shí)使得淀粉基聚合物獲得溫度敏感性。反應(yīng)在堿催化下遵循親核取代機(jī)理進(jìn)行,淀粉在堿的催化下產(chǎn)生氧負(fù)離子,產(chǎn)生的氧負(fù)離子越多,親核取代也就越容易發(fā)生。其次,膠束的親水性外殼需要具有良好的生物相容性,聚乙二醇由于其突出的物化和生物性質(zhì)(無(wú)毒、無(wú)抗原性和無(wú)免疫原性)使其在制備兩親性聚合物時(shí)常常被作為一種可溶性的聚合物改性劑,用其所制得的聚合物有很高的兩親性,生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇的特性滿足作為負(fù)載膠束親水外殼這一要求。根據(jù)酯化反應(yīng)機(jī)理,用羧基封端的聚乙二醇對(duì)淀粉進(jìn)行親水基的修飾。最終得到產(chǎn)物R-St-mPEG。合成過(guò)程如圖1所示。

圖1 淀粉基聚合物(R-St-mPEG)的合成路線圖Fig.1 The synthetise of starch based polymer(R-St-mPEG)

2.2 聚合物結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 傅里葉紅外變換光譜(FTIR)結(jié)果分析 聚合物紅外光譜如圖2所示,由圖2中可以得知,與原淀粉(St)紅外圖相比,疏水淀粉(St-R)譜圖發(fā)生了新的變化。在1014～1160 cm-1出現(xiàn)新的寬強(qiáng)峰,這是縮水甘油醚接枝淀粉后的醚鍵的特征吸收峰[21]。1646和1465 cm-1兩處的吸收峰屬于C-H的彎曲振動(dòng)[19]。3444 cm-1處的峰變強(qiáng)變寬,這是因?yàn)樵诘矸鄯肿渔溕弦肟s水甘油醚后新增加的羥基所引起的。而與淀粉接枝縮水甘油醚(St-R)相比,疏水淀粉接枝聚乙二醇(R-St-mPEG)的紅外譜圖也出現(xiàn)了新的變化。1735 cm-1出現(xiàn)了羰基的特征吸收峰,這是羧基封端聚乙二醇接枝到淀粉上的重要標(biāo)志。還有1110 cm-1處出現(xiàn)了明顯的酯鍵吸收峰[21]。此外,圖中2881～2977 cm-1之間的峰在不斷變寬變強(qiáng),這是由于淀粉分子上引入了烷基類基團(tuán)所導(dǎo)致的。這些證據(jù)都在一定程度上證明淀粉接枝聚合物(R-St-mPEG)的成功合成。核磁共振氫譜和紅外變換光譜相輔才能進(jìn)一步證明聚合物的成功合成。

圖2 淀粉基聚合物(R-St、R-St-mPEG)及原淀粉(St)紅外光譜圖(FTIR)Fig.2 The infrared spectrum(FTIR)of starch-based polymer(R-St,R-St-mPEG)and starch(St)

2.2.2 核磁共振氫譜(1H-NMR)結(jié)果 利用核磁共振氫譜對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步表征,如圖3為淀粉基聚合物的核磁共振氫譜圖。由圖中則可以看出淀粉葡萄糖環(huán)(AGU)上各氫的質(zhì)子峰都可以被明顯的觀察到,分別是5.6 ppm(20)、5.3 ppm(19)以及5.1 ppm(1)位置處的三個(gè)質(zhì)子峰。除此之外,出現(xiàn)在化學(xué)位移δ=3.51和3.23 ppm處的質(zhì)子峰分別歸屬于mPEG上的亞甲基和末端甲基,這些結(jié)果與文獻(xiàn)對(duì)照一致[22]。淀粉分子骨架上除了親水性的聚乙二醇(mPEG)之外,還引入了疏水性的縮水甘油醚,根據(jù)文獻(xiàn)可知[21,23],異丙基縮水甘油醚亞甲基中(H14,H15)的各質(zhì)子峰出現(xiàn)在3.0～3.8 ppm之間,H17、H18出現(xiàn)在0.75 ppm附近,以及1.4和1.5 ppm附近的H16。這些證據(jù)都證明聚合物中接枝的各個(gè)基團(tuán)都出現(xiàn)在了產(chǎn)物中,與紅外光譜中特征官能團(tuán)的譜圖共同證明了聚合物(R-St-mPEG)的成功合成。

圖3 淀粉基聚合物(R-St-mPEG)的核磁共振氫譜圖(1H-NMR)Fig.3 Nuclear magnetic resonance spectrum ofstarch-based polymer(R-St-mPEG)

2.3 臨界膠束濃度(CMC)測(cè)定結(jié)果

臨界膠束濃度是證明膠束自組裝行為發(fā)生的重要參數(shù),同時(shí)也能夠說(shuō)明藥物載體在體內(nèi)長(zhǎng)效循環(huán)中的穩(wěn)定性[24]。以芘做熒光探針,當(dāng)芘從親水環(huán)境轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境的過(guò)程中,當(dāng)聚合物濃度達(dá)到某個(gè)值的時(shí)候芘的熒光強(qiáng)度發(fā)生突變,這個(gè)濃度被定義為臨界膠束濃度(CMC)。如圖4所示,以芘的熒光強(qiáng)度比值(I318/I332)和聚合物濃度的對(duì)數(shù)(Log C)作圖,圖中拐點(diǎn)所示即為聚合物R-St-mPEG的臨界膠束濃度。拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度為0.339 mg/mL。說(shuō)明當(dāng)聚合物膠束在溶液中的濃度達(dá)到0.339 mg/mL時(shí),聚合物便能發(fā)生自組裝行為。疏水性基團(tuán)向內(nèi)卷曲形成疏水內(nèi)核,親水性基團(tuán)向外部排列形成親水性外殼。此外,臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定為聚合物膠束負(fù)載功能性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ),當(dāng)膠束發(fā)生自組裝行為時(shí),可以與姜黃素溶液混合,將姜黃素分子成功包裹進(jìn)膠束的疏水內(nèi)核中。

圖4 芘的熒光強(qiáng)度比值與膠束濃度對(duì)數(shù)圖Fig.4 Pyrene fluorescence intensity ratioand micelle concentration logarithm plot

2.4 聚合物(R-St-mPEG)透射電鏡(TEM)結(jié)果表征

透射電鏡可以對(duì)膠束的形貌進(jìn)行表征,由于人體正常組織環(huán)境pH為7.4,所以為了保證膠束負(fù)載后進(jìn)入體內(nèi)能夠穩(wěn)定輸送藥物,選用在pH7.4的磷酸緩沖液中對(duì)膠束分散后觀察其形貌。圖5所示為膠束在pH=7.4 PBS緩沖溶液中50 h后的形貌圖。由圖中可以看到,膠束呈現(xiàn)球形和橢球型結(jié)構(gòu),粒徑不均一。膠束在存放50 h后仍舊能夠保持球形結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生坍塌或者破裂,這為后續(xù)膠束的負(fù)載提供了有利的穩(wěn)定環(huán)境。負(fù)載膠束在進(jìn)入人體后若是發(fā)生結(jié)構(gòu)的坍塌或者破裂,將導(dǎo)致提前釋放和削弱膠束的緩釋效果。此外,透射電鏡結(jié)果也表明了通過(guò)自組裝行為形成了球形結(jié)構(gòu)。

圖5 聚合物膠束的透射電鏡(TEM)圖Fig.5 TEM of polymer micelles

2.5 聚合物粒度分析

聚合物膠束作為藥物載體,其粒徑小于200 nm時(shí),膠束能夠顯示出較好增強(qiáng)滲透性和滯留(EPR)效應(yīng)[27]。通過(guò)馬爾文激光納米粒度散射儀可以測(cè)量聚合物膠束在溶液中粒徑,圖6所示為聚合物膠束在pH=7.4的緩沖溶液中的粒徑分布圖。粒徑集中分布在28和122 nm附近。粒徑分布不均一主要是聚合物基材淀粉的性質(zhì)所導(dǎo)致的,淀粉本身粘度大,淀粉之間容易發(fā)生粘連[28],當(dāng)?shù)矸鄯肿又g發(fā)生粘連時(shí),勢(shì)必會(huì)造成粒徑測(cè)量結(jié)果較大。此外,膠束的粒徑分布不均一與透射電鏡結(jié)果也相符,這也證明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

圖6 膠束的粒徑分布圖Fig.6 Particle size distribution of micelles

2.6 負(fù)載性能分析

為了獲得負(fù)載膠束中姜黃素的載藥量(DLC),稱取一定量負(fù)載有姜黃素的負(fù)載膠束溶解在DMSO中,利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)在427 nm處的吸光強(qiáng)度,然后再通過(guò)姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算濃度,姜黃素在DMSO中標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合良好。如圖8所示為不同投藥量膠束的載藥量,根據(jù)1.2.5.1中的式1計(jì)算可得,當(dāng)材料投入100 mg,姜黃素投入量為14 mg時(shí),膠束有最大負(fù)載量,負(fù)載量為18.47%。聚合物的投入量與藥物濃度之間有著密切的聯(lián)系,當(dāng)藥物濃度較小時(shí),膠束在形成時(shí),藥物不能完全占據(jù)膠束的內(nèi)核空間,導(dǎo)致負(fù)載量不能達(dá)到飽和。當(dāng)逐步增大藥物濃度時(shí),負(fù)載量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),這是由于姜黃素在水中的穩(wěn)定性較差[25],隨著DMSO不斷透析被除去,聚合物還未在水溶液中形成核-殼結(jié)構(gòu)的膠束時(shí),姜黃素便已經(jīng)結(jié)晶析出,姜黃素發(fā)生聚集,導(dǎo)致負(fù)載量也隨著姜黃素濃度的增大而出現(xiàn)減小趨勢(shì)。所以聚合物材料的投加與藥物濃度之間需要有合適的比例。

圖7 姜黃素在DMSO中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of curcumin in DMSO

圖8 不同投藥量下的膠束負(fù)載量Fig.8 Micelle loads at different dosages

2.7 聚合物膠束的溫敏性能考察

人體內(nèi)各組織之間的溫度也會(huì)存在一定的差異,腫瘤組織的溫度明顯高于人體正常體溫,這也為開發(fā)溫度敏感型的負(fù)載膠束提供了先決條件。溫度敏感型聚合物膠束的釋放機(jī)理主要與外界環(huán)境的溫度有關(guān),當(dāng)溫度高于聚合物的臨界溫度時(shí),聚合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變,導(dǎo)致膠束的核-殼結(jié)構(gòu)收縮從而釋放。當(dāng)溫度對(duì)于臨界溫度時(shí),聚合物膠束分子上的羥基、氧、烷氧基等與溶液中的水分子形成氫鍵,膠束的核殼結(jié)構(gòu)也會(huì)更加穩(wěn)定,功能性物質(zhì)姜黃素通過(guò)擴(kuò)散和滲透作用[26]從膠束中進(jìn)行釋放。根據(jù)上述機(jī)理,采用常溫和人體外環(huán)境溫度兩個(gè)條件下考察淀粉基聚合物R-St-mPEG的溫度敏感性和緩釋性能。首先繪制了姜黃素在磷酸緩沖液(PBS)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖9),線性擬合度良好。間隔不用時(shí)間取樣,然后測(cè)定溶液的吸光度,根據(jù)式2計(jì)算負(fù)載膠束的累計(jì)釋放量,并以時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖(如圖10)。由圖中可以看出33 h以前,25 ℃環(huán)境中的膠束累計(jì)釋放量大于37 ℃環(huán)境中的累計(jì)釋放量,這是由于37 ℃環(huán)境中的負(fù)載膠束會(huì)經(jīng)歷膠束球形結(jié)構(gòu)收縮的過(guò)程,膠束更加緊密,導(dǎo)致藥物通過(guò)擴(kuò)散和滲透方式釋放變慢。30～52 h之間,37 ℃環(huán)境中的膠束大于收縮更加緊密膠束中的藥物通過(guò)“擠出”方式釋放,產(chǎn)生突釋效應(yīng),累計(jì)釋放量變大。而25 ℃環(huán)境中的膠束一直處于平穩(wěn)的釋放階段,沒有突釋階段,這也符合膠束通過(guò)擴(kuò)散和滲透作用逐步釋放的機(jī)理。60 h內(nèi)37 ℃環(huán)境中的膠束累計(jì)釋放量達(dá)到了43.9%,25 ℃環(huán)境中的負(fù)載膠束累計(jì)釋放量只有34.7%。負(fù)載膠束的累計(jì)釋放結(jié)果表明淀粉基聚合物R-St-mPEG具備溫度敏感性能,隨著溫度的升高釋放量也會(huì)不斷增加。

圖9 姜黃素在PBS緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of curcumin in PBS buffer

圖10 負(fù)載膠束在不同環(huán)境中的釋放曲線Fig.10 Release curves of loadedmicelles in different environments

3 結(jié)論

本研究首先用異丙基縮水甘油醚改性木薯淀粉制備了疏水化淀粉R-St,然后用生物相容性好的親水性基團(tuán)mPEG進(jìn)行修飾,得到了一種新型兩親性的淀粉基聚合物R-St-mPEG。利用芘的熒光探針法表征了聚合物的自組裝行為,當(dāng)聚合物膠束濃度達(dá)到0.339 mg/mL時(shí),膠束能夠發(fā)生自組裝行為。利用透射電鏡進(jìn)一步表征膠束的形貌,發(fā)現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)球形和橢球形。為了探明膠束的粒徑,利用馬爾文激光納米粒度散射儀對(duì)膠束粒徑進(jìn)行測(cè)定,膠束粒徑集中分布在兩個(gè)區(qū)域,28和122 nm,與透射電鏡結(jié)果相符。此外,通過(guò)負(fù)載抗癌藥物姜黃素考察了膠束的負(fù)載性能,膠束與姜黃素之間需要合適的比例才能夠達(dá)到最大負(fù)載量,當(dāng)膠束投加量為100 mg,姜黃素投加量為14 mg時(shí),聚合物膠束具有最大負(fù)載量為18.47%。體外釋放結(jié)果表明聚合物膠束(R-St-mPEG)釋放是一個(gè)緩慢而穩(wěn)定的過(guò)程,在溫度較高的條件下,聚合物膠束的釋放速度明顯較快,37 ℃環(huán)境中,膠束60 h內(nèi)累計(jì)釋放量為43.9%,而在25 ℃環(huán)境中,60 h內(nèi)膠束的累計(jì)釋放量為34.7%。證明聚合物膠束具有溫度響應(yīng)性。本研究證明兩親性聚合R-St-mPEG膠束能夠有效包裹和釋放藥物,能夠成為有效的藥物載體。