高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定芝麻制品中木脂素及生育酚含量的研究

閆 蒼，郝征紅，劉 瑩，趙德川，鄒文皓，王明輝

(山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250100)

芝麻是一種古老的油料作物，在我國(guó)有著上千年的種植歷史，作為芝麻生產(chǎn)大國(guó)，我國(guó)的芝麻主要用于榨油和制作芝麻醬。芝麻具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及生理活性功能，木脂素和生育酚等作為芝麻中重要的抗氧化活性物質(zhì)而備受食品消費(fèi)市場(chǎng)的青睞[1]。芝麻制品中的木脂素及生育酚的含量不僅是評(píng)價(jià)芝麻制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是培育優(yōu)良芝麻品種的重要判定依據(jù)[2]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，檢測(cè)芝麻及其制品中的木脂素及生育酚的方法有薄層色譜法(TLC)[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4]，檢測(cè)油脂中生育酚的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5]、超臨界流體色譜法(SFC)[6]，對(duì)樣品的預(yù)處理方法有皂化法[4]、超聲波提取法[7]、固相萃取法[8]等。目前現(xiàn)有方法及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)多為木脂素及生育酚類(lèi)化合物的單項(xiàng)檢測(cè)[4]。本文在已有研究的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了超聲波提取條件，建立了對(duì)芝麻酚、芝麻素、芝麻林素及生育酚等多組分同時(shí)檢測(cè)的HPLC方法,并對(duì)市售不同工藝條件的芝麻油和黑、白芝麻醬中木脂素及生育酚含量進(jìn)行分析，為芝麻油及芝麻醬生產(chǎn)工藝的改良提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

市售壓榨和水代工藝芝麻油(產(chǎn)地山東、上海等地)、白芝麻醬(產(chǎn)地河北涿州市)、黑芝麻醬(產(chǎn)地河北廊坊市)。芝麻素標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)，芝麻林素、芝麻酚標(biāo)準(zhǔn)品(成都德思特生物技術(shù)有限公司)，α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)，β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大TRC研究化學(xué)公司)，γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Alta科技有限公司)，δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)。

Waters1525高效液相色譜儀、Symmetry C18色譜柱(美國(guó)Waters科技制造有限公司)，超聲微波聯(lián)合反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐儀器制造有限公司)，勻漿儀(德國(guó)IKA實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

1.2.1.1 勻漿法

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g芝麻醬樣品放入100 mL燒杯中，加入80 mL甲醇，用勻漿儀在中高速檔位條件下勻漿3～4 min，使其均勻混合，勻漿完成后，離心定容，待HPLC分析。

1.2.2.2 超聲波輔助甲醇萃取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.6 g芝麻油樣品，加入72 mL甲醇，料液比1∶120；準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g芝麻醬樣品，加入80 mL甲醇，料液比1∶80。將溶解的芝麻油和芝麻醬樣品分別置于超聲反應(yīng)系統(tǒng)中，條件為超聲波功率320 W、超聲時(shí)間20 min、轉(zhuǎn)速240 r/min、溫度30℃，然后靜置冷卻至室溫，離心定容，待HPLC分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 mg芝麻酚、10 mg芝麻素和20 mg芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入甲醇溶解并定容至50 mL，分別配成100 μg/mL芝麻酚、200 μg/mL芝麻素和400 μg/mL芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mgα-生育酚、1 mgβ-生育酚、2.5 mgγ-生育酚、2 mgδ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品,分別加入甲醇溶解并定容至10 mL，配成100 μg/mLα-生育酚、100 μg/mLβ-生育酚、250 μg/mLγ-生育酚、200 μg/mLδ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于-18℃環(huán)境下儲(chǔ)藏，待HPLC測(cè)定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；WatersC18保護(hù)柱；Waters 2489紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)；柱溫35℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序：時(shí)間梯度為0 min→5 min→6 min→14 min→16 min→31 min→32 min→33 min，相應(yīng)流動(dòng)相濃度梯度為0%A→60%A→75%A→75%A→100%A→100%A→60%A→60%A。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

將上述配制的木脂素及生育酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為不同質(zhì)量濃度，各取10 μL按照1.2.3色譜條件測(cè)定各組分的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)擬合線(xiàn)性回歸方程。

1.2.4.2 回收率測(cè)定

向已知木脂素及生育酚含量的樣品中，添加樣品中木脂素及生育酚含量0.8～1.5倍的標(biāo)準(zhǔn)品，按1.2.3色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.4.3 精密度測(cè)定

分別取芝麻油和芝麻醬樣品進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算木脂素及生育酚類(lèi)化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于芝麻酚等木脂素與生育酚類(lèi)化合物的極性不同，為使芝麻酚、芝麻素、芝麻林素3種木脂素和生育酚類(lèi)化合物能夠有效分離，選擇甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相，通過(guò)不斷調(diào)整兩者的比例使得木脂素和生育酚類(lèi)化合物達(dá)到理想的分離效果，故采用梯度洗脫的方式。在4 min時(shí)，甲醇和水比例為60∶40，芝麻酚能夠有效分離，進(jìn)一步增加甲醇比例(體積分?jǐn)?shù)75%)使芝麻素和芝麻林素快速分離，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%以上時(shí)，α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚(β-生育酚)能有效分離。將7種木脂素與生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，取10 μL按照1.2.3色譜條件進(jìn)行HPLC分析測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，檢測(cè)可在33 min內(nèi)完成，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)木脂素和生育酚類(lèi)化合物的定性定量分析。梁少華等[9]研究發(fā)現(xiàn)，白芝麻及其油脂中未檢出β-生育酚。李桂華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黑芝麻及其油脂中未檢出β-生育酚。因此，本文使用的C18色譜柱雖然未能分離γ-生育酚和β-生育酚，但芝麻制品γ-生育酚峰中應(yīng)不包含或極少包含β-生育酚峰，所以不影響檢測(cè)數(shù)據(jù)。

注：1.芝麻酚；2.芝麻素；3.芝麻林素；4.δ-生育酚；5.γ-生育酚+β-生育酚；6.α-生育酚。

圖1 木脂素和生育酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

2.2 不同前處理方法的比較

將待測(cè)的白芝麻醬樣品分別采用勻漿法和超聲波輔助甲醇萃取法兩種前處理方法進(jìn)行處理，然后HPLC分析木脂素和生育酚含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同前處理方法測(cè)定木脂素及生育酚含量比較

由圖2可知，采用超聲波輔助甲醇萃取前處理的木脂素及生育酚含量均高于勻漿前處理。并且待測(cè)樣品采用超聲波方法提取后，經(jīng)測(cè)定，HPLC圖譜雜峰較少。因此，采用超聲波輔助甲醇萃取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

2.3 芝麻油超聲波前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 超聲波功率的影響

在料液比1∶90、超聲時(shí)間20 min的條件下，考察不同超聲波功率對(duì)芝麻油中木脂素及生育酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，隨著超聲波功率的增加，木脂素及生育酚總含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲波功率超過(guò)320 W之后，總含量開(kāi)始下降。因此，超聲波功率為320 W時(shí)提取效果最佳。

圖3 超聲波功率對(duì)芝麻油中木脂素及生育酚提取的影響

2.3.1.2 料液比的影響

在超聲波功率320 W、超聲時(shí)間20 min的條件下，考察不同料液比對(duì)芝麻油中木脂素及生育酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)芝麻油中木脂素及生育酚提取的影響

從圖4可以看出，隨著料液比的增加，木脂素及生育酚總含量逐漸增加，在料液比超過(guò)1∶120之后，總含量趨于穩(wěn)定。因此，料液比為1∶120時(shí)提取效果最佳。

2.3.1.3 超聲時(shí)間的影響

在超聲波功率320 W、料液比1∶120條件下，考察不同超聲時(shí)間對(duì)芝麻油中木脂素及生育酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)芝麻油中木脂素及生育酚提取的影響

從圖5可以看出，超聲時(shí)間延長(zhǎng)至15 min后，木脂素及生育酚總含量增加趨勢(shì)明顯，20 min后芝麻油中木脂素及生育酚總含量呈下降趨勢(shì)。因此，超聲時(shí)間為20 min時(shí)提取效果最佳。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 以超聲時(shí)間、料液比、超聲波功率為因素,以生育酚及木脂素總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化芝麻油超聲波前處理?xiàng)l件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芝麻油超聲波前處理正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1可知：影響超聲波提取的主要因素順序?yàn)槌暡üβ?料液比>超聲時(shí)間。確定超聲波功率320 W、料液比1∶120、超聲時(shí)間20 min為芝麻油樣品超聲波前處理的最佳條件。

2.4 芝麻醬超聲波前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1.1 超聲波功率的影響

在料液比1∶80、超聲時(shí)間20 min的條件下，考察不同超聲波功率對(duì)芝麻醬中木脂素及生育酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 超聲波功率對(duì)芝麻醬中木脂素及生育酚提取的影響

從圖6可以看出，隨著超聲波功率增加，木脂素及生育酚總含量也隨之增加，但超過(guò)320 W后，木脂素及生育酚總含量下降趨勢(shì)明顯。因此，超聲波功率為320 W時(shí)提取效果最佳。

2.4.1.2 料液比的影響

在超聲波功率320 W、超聲時(shí)間20 min的條件下，考察不同料液比對(duì)芝麻醬中木脂素及生育酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

從圖7可以看出，隨著料液比的增加，木脂素及生育酚總含量增加趨勢(shì)明顯，當(dāng)料液比達(dá)到1∶80后，木脂素及生育酚總含量略有下降且趨于穩(wěn)定。因此，料液比為1∶80時(shí)提取效果最佳。

圖7 料液比對(duì)芝麻醬中木脂素及生育酚提取的影響

2.4.1.3 超聲時(shí)間的影響

在料液比1∶80、超聲波功率320 W的條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)芝麻醬中木脂素及生育酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)芝麻醬中木脂素及生育酚提取的影響

從圖8可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，木脂素及生育酚總含量略有起伏，在超聲時(shí)間20 min時(shí)木脂素及生育酚總含量達(dá)到最大值，20 min 后木脂素及生育酚總含量下降趨勢(shì)明顯。因此，超聲時(shí)間為20 min 時(shí)提取效果最佳。

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 以超聲時(shí)間、料液比、超聲波功率為因素，以生育酚及木脂素總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo), 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化芝麻醬中木脂素及生育酚的提取。芝麻醬超聲波前處理正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芝麻醬超聲波前處理正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，影響超聲波提取的主要因素順序?yàn)槌暡üβ?料液比>超聲時(shí)間。確定超聲波功率320 W、料液比1∶80、超聲時(shí)間20 min為芝麻醬超聲波前處理的最佳條件。

2.5 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢出限、定量限

芝麻酚、芝麻素、芝麻林素、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限見(jiàn)表3。

表3 木脂素和生育酚類(lèi)化合物的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

由表3可知，芝麻酚、芝麻素、芝麻林素、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚線(xiàn)性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線(xiàn)性關(guān)系良好。檢出限和定量限以向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法來(lái)確定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜響應(yīng)值計(jì)算，當(dāng)信噪比(S/N)為3時(shí)，木脂素類(lèi)化合物的檢出限為0.43～0.67 mg/kg，生育酚類(lèi)化合物的檢出限為0.54～0.98 mg/kg。當(dāng)信噪比(S/N)為10時(shí)，木脂素類(lèi)化合物的定量限為1.33～2.12 mg/kg，生育酚類(lèi)化合物的定量限為1.81～2.84 mg/kg。

2.6 回收率

取已知木脂素及生育酚含量的芝麻油和黑芝麻醬樣品，向芝麻油樣品中加入已知量的芝麻酚、芝麻素、芝麻林素、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，向黑芝麻醬樣品中加入已知量的δ-生育酚、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表4結(jié)果可知，3種木脂素類(lèi)化合物及γ-生育酚、α-生育酚、δ-生育酚的平均加標(biāo)回收率在88.5%～108.4%之間，加標(biāo)回收率結(jié)果良好。

2.7 精密度

取某一芝麻油和黑芝麻醬樣品，采用優(yōu)化的條件對(duì)其進(jìn)行超聲波前處理后，按照1.2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)(n=5)。測(cè)定3種木脂素和3種生育酚類(lèi)化合物含量并計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，3種木脂素類(lèi)化合物和3種生育酚類(lèi)化合物RSD小于等于4.8%，表明該分析方法精密度良好，準(zhǔn)確度高。

2.8 樣品測(cè)定

分別選取了市面在售的壓榨和水代工藝條件下的芝麻油樣品、1種芝麻調(diào)和油樣品、1種白芝麻醬和1種黑芝麻醬樣品，采用優(yōu)化的超聲波工藝對(duì)其進(jìn)行前處理后，按照1.2.3色譜條件測(cè)定其中的木脂素及生育酚含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，芝麻油及芝麻醬中均含有豐富的木脂素及生育酚類(lèi)化合物。5種芝麻油樣品中，芝麻素占木脂素總量的51%～65%,芝麻林素占木脂素總量的31%～45%，芝麻酚含量較少，測(cè)定結(jié)果與李丹丹等[11]的一致。黑芝麻醬中芝麻素含量低于白芝麻醬，與葉子晨等[12]的研究結(jié)果一致。在生育酚含量方面，芝麻油中生育酚主要以γ-生育酚為主，白芝麻醬中生育酚主要以γ-生育酚為主，而黑芝麻醬中生育酚主要以α-生育酚為主,與梁少華[9]、李桂華[10]等的研究結(jié)果一致。

表6 市售芝麻油及芝麻醬的木脂素及生育酚含量 mg/g

注：“-”表示含量小于等于10-3mg/g。

3 結(jié) 論

本文選用超聲波輔助甲醇萃取法對(duì)芝麻油和芝麻醬進(jìn)行前處理，并且優(yōu)化了超聲波提取條件，建立了處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、操作方便的樣品前處理方法。利用Symmetry C18分離柱，以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，建立了同時(shí)分析測(cè)定芝麻油及芝麻醬中木脂素和生育酚的高效液相色譜法。該方法簡(jiǎn)單快捷，在33 min內(nèi)可以同時(shí)完成對(duì)木脂素和生育酚的定性定量分析測(cè)定，并且峰形良好，分離度高，雜峰較少。3種木脂素類(lèi)化合物和3種生育酚類(lèi)化合物線(xiàn)性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)均大于0.99。3種木脂素類(lèi)化合物和3種生育酚類(lèi)化合物平均回收率在88.5%～108.4%之間，精密度在2.4%～4.8%之間，是一種準(zhǔn)確度較高、簡(jiǎn)單快捷的分析檢測(cè)方法。