NOD1、SIRT1、IL-1β及MMP3與胎膜早破關(guān)系的研究

宋春紅，楊蓉娟，甄娟△，吳莎，韓彥潔

胎膜早破（premature rupture of the membranes，PROM）嚴(yán)重影響母嬰健康，其發(fā)病與感染、營養(yǎng)、社會經(jīng)濟(jì)因素密切相關(guān)，涉及炎癥、凋亡、基因多態(tài)性等多種調(diào)控途徑。雖經(jīng)大量研究，PROM 的病因?qū)W及其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床上對其預(yù)測和防治仍不理想。研究表明，宮內(nèi)感染及絨毛膜羊膜炎是造成PROM 的最重要原因之一［1-2］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體（NOD）1 作為模式識別受體之一，可以識別細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖及其裂解產(chǎn)物內(nèi)消旋-二氨基庚二酸（iE-DAP），介導(dǎo)細(xì)菌引起的炎癥反應(yīng)［3］。沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白（SIRT）1屬于SIRT家族，具有乙?；富钚?，可發(fā)揮維持基因組穩(wěn)定性、抗 氧化及抗炎作用［4］。目前對NOD1、SIRT1 在PROM中的作用研究較少。本研究通過檢測胎膜早破患者胎膜組織NOD1、SIRT1表達(dá)及羊水基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3 與白細(xì)胞介素（IL）-1β 水平，分析各分子表達(dá)的相關(guān)性，以期從因子水平深入探討PROM的發(fā)病機(jī)制，尋找新的預(yù)防及治療途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月—2016年12月在本院產(chǎn)檢并住院、以剖宮產(chǎn)結(jié)束分娩的單胎初產(chǎn)婦90例，分組情況如下：（1）足月胎膜早破（term premature rupture of the fetal membranes，tPROM）組30 例，年齡（29.3±2.7）歲，孕（38.9±1.1）周。（2）未足月胎膜早破（preterm premature rupture of the fetal membranes，pPROM）組30 例，年齡（26.2±4.0）歲，孕（35.0±1.0）周。（3）正常對照組（正常足月妊娠婦女）30 例，年齡（28.7±3.5）歲，孕（38.7±1.1）周。3組產(chǎn)婦無羊水過多、妊娠期高血壓等并發(fā)癥，無胎兒染色體異常。PROM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參見樂杰等主編的第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》。PROM組破膜至新生兒出生時間間隔＜12 h，剖宮產(chǎn)前均未臨產(chǎn)、未使用抗生素預(yù)防感染。tPROM組羊水細(xì)菌培養(yǎng)陽性率26.7%，pPROM組細(xì)菌培養(yǎng)陽性率33.3%，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.317，P＞0.05）。本試驗經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，采集標(biāo)本均經(jīng)過知情同意。

1.2 標(biāo)本采集 孕婦行剖宮產(chǎn)手術(shù)時取羊水5 mL，離心后取上清液，-70 ℃冰箱保存。胎盤娩出后，于胎膜破口附近處取全層胎膜組織，一部分以滅菌生理鹽水漂凈后，放于凍存管中-70 ℃保存、備用；另一部分胎膜組織制作胎膜卷放于10%中性福爾馬林溶液固定24 h。

1.3 主要試劑 兔抗人NOD1 多克隆一抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗人SIRT1多克隆一抗購自美國Sigma公司，山羊抗兔二抗、免疫組化通用型SP 檢測試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰?，兔抗人β-actin 單克隆一抗及IL-1β、MMP3 ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程公司。

1.4 免疫組化染色檢測胎膜組織中NOD1 及SIRT1 的表達(dá)部位 采用SP法。胎膜組織固定后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、切片，嚴(yán)格按實驗流程進(jìn)行免疫組化操作。觀察NOD1 及SIRT1 在胎膜組織中的表達(dá)部位。判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜/漿/核出現(xiàn)清晰的黃色、棕黃色或棕褐色，陰性細(xì)胞表現(xiàn)為染色與背景一致或無明顯著色。

1.5 Western blot 檢測胎膜組織NOD1 及SIRT1 蛋白表達(dá)水平 胎膜組織剪碎后，用RIPA 細(xì)胞裂解液法提取胎膜勻漿蛋白，測濃度后取60 μg 蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，用Bio-Rad 轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，結(jié)束后將薄膜放入5%脫脂奶粉封閉，NOD1 及SIRT1 一抗4 ℃過夜。第2 天洗膜后加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，洗滌，增強(qiáng)化學(xué)熒光發(fā)光法暗室曝光顯影。對圖像進(jìn)行掃描，以各目的蛋白與β-actin的吸光度值比值作為各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 羊水IL-1β及MMP3水平檢測 羊水中IL-1β及MMP3水平測定采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。采用直線相關(guān)分析分析兩變量相關(guān)性。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD1 及SIRT1 在胎膜組織中的表達(dá)部位 在胎膜組織，NOD1主要表達(dá)于羊膜上皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞漿，PROM 組胎膜組織中NOD1 表達(dá)強(qiáng)度高于正常對照組，pPROM 組NOD1表達(dá)強(qiáng)度高于tPROM組。SIRT1主要表達(dá)于蛻膜細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核及細(xì)胞漿，少量表達(dá)于羊膜上皮細(xì)胞核及細(xì)胞漿，PROM 組胎膜組織中SIRT1表達(dá)較正常對照組降低，見圖1。

Fig.1 Expressions of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes(DAB,×100)圖1 NOD1及SIRT1在胎膜組織中的表達(dá)（DAB,×100）

2.2 各組胎膜組織中NOD1及SIRT1的表達(dá)水平比較 tPROM 組、pPROM 組胎膜組織中NOD1 相對表達(dá)水平較正常對照組升高（P＜0.05），pPROM 組NOD1 表達(dá)高于tPROM 組（P＜0.05）。tPROM 組、pPROM 組胎膜組織中SIRT1 相對表達(dá)水平較正常對照組降低（P＜0.05），tPROM組與pPROM組SIRT1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表1。

Fig.2 Expressions of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes measured by Western blot assay圖2 NOD1及SIRT1在胎膜組織中的蛋白表達(dá)水平

Tab.1 Expression levels of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes measured by Western blot assay表1 各組胎膜組織中NOD1及SIRT1蛋白灰度值與β-actin比值（n=30，±s）

Tab.1 Expression levels of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes measured by Western blot assay表1 各組胎膜組織中NOD1及SIRT1蛋白灰度值與β-actin比值（n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與tPROM組比較，P＜0.05

組別正常對照組tPROM組pPROM組F NOD1/β-actin 0.53±0.16 1.00±0.19a 1.10±0.17ab 92.747＊＊SIRT1/β-actin 0.95±0.20 0.57±0.15a 0.55±0.18a 48.849＊＊

2.3 各組羊水IL-1β、MMP3 水平比較 tPROM 組、pPROM 組羊水IL-1β、MMP3 水平較正常對照組顯著升高（均P＜0.05），pPROM 組較tPROM 組表達(dá)水平升高（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 The expression levels of IL-1β and MMP3 in amniotic fluid in three groups表2 各組羊水IL-1β及MMP3水平（n=30，±s）

Tab.2 The expression levels of IL-1β and MMP3 in amniotic fluid in three groups表2 各組羊水IL-1β及MMP3水平（n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與tPROM組比較，P＜0.05

組別正常對照組tPROM組pPROM組F IL-1β（ng/L）3.37±1.17 12.76±3.31a 17.69±4.98ab 128.178＊＊MMP3（μg/L）1.81±0.72 2.17±0.64a 2.75±0.69ab 18.426＊＊

2.4 NOD1、SIRT1 與IL-1β 及MMP3 水平的相關(guān)性分析 胎膜組織中NOD1 表達(dá)與羊水IL-1β、MMP3水平呈正相關(guān)（r分別為0.509、0.598，P＜0.01）；胎膜組織中SIRT1表達(dá)與羊水IL-1β、MMP3水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.408、-0.337，P＜0.01）。

3 討論

感染與炎癥在PROM發(fā)生中占主要原因且與其互為因果［5］。炎癥可以導(dǎo)致炎性因子釋放增加，前列腺素、MMP合成及激活，導(dǎo)致胎膜破裂、宮頸擴(kuò)張從而發(fā)動分娩。NOD1激活可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，激活炎癥反應(yīng)，SIRT1 可以抑制炎癥反應(yīng)，目前對NOD1及SIRT1在PROM中的研究較少，本研究重點關(guān)注PROM 患者NOD1、SIRT1、IL-1β 與MMP3的表達(dá)及其相互關(guān)系。

MMP 對細(xì)胞外基質(zhì)的降解在PROM 發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。MMP3 是MMP 家族中重要一員，在宮頸、妊娠相關(guān)組織如胎盤、胎膜中表達(dá)，在分娩、PROM、細(xì)胞因子誘導(dǎo)等情況下，MMP3生成及激活，降解、破壞細(xì)胞外基質(zhì)及基膜，并激活其他類型的MMP，促使胎膜張力減弱，促進(jìn)PROM 的發(fā)生［6-7］。本研究結(jié)果顯示，PROM 組羊水中MMP3 表達(dá)水平較正常對照組增高，促進(jìn)了胎膜細(xì)胞外基質(zhì)水解。

宮內(nèi)感染發(fā)生后，可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子如IL-1β及趨化因子釋放。趨化因子促進(jìn)子宮和胎膜白細(xì)胞募集，進(jìn)一步導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子（如IL-1β及IL-6）釋放。IL-1β可以激活環(huán)氧合酶2、促進(jìn)子宮前列腺素產(chǎn)生，促進(jìn)MMP 表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解及PROM 的發(fā)生［8］。在巴西人群中，IL1β-31T（rs1143627）多態(tài)性位點與未足月PROM/早產(chǎn)家族史及分娩時間相關(guān)［9］。本研究顯示，PROM組患者羊水中IL-1β 水平較正常對照組升高，與PROM發(fā)生相關(guān)。

NOD1 屬于胞漿內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族成員，可以識別細(xì)胞漿內(nèi)病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。NOD1可以識別革蘭陰性細(xì)菌及一些革蘭陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖及其裂解產(chǎn)物iE-DAP，激活受體相互作用絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶2，通過系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終激活核因子（NF）-κB，使其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，促使靶基因轉(zhuǎn)錄，如編碼IL-6、IL-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 基因［10］；亦可激活絲裂原活化蛋白激酶類分子途徑，促進(jìn)促炎分子如IL-1β、IL-6 及TNF-α的表達(dá)，從而激活免疫應(yīng)答［11-12］。NOD1存在于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，在足月胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，NOD1被iE-DAP 激活后，可以導(dǎo)致IL-6 及單核細(xì)胞趨化蛋白1 等分泌；給予C57BL/6J 孕小鼠模型大劑量iEDAP 可在20 h 內(nèi)導(dǎo)致小鼠早產(chǎn)；低劑量iE-DAP 雖不會導(dǎo)致早產(chǎn)但可以導(dǎo)致胎鼠體內(nèi)產(chǎn)生眾多細(xì)胞因子和趨化因子［13］。在體外培養(yǎng)羊膜細(xì)胞中，NOD1激活可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子如IL-1β 和IL-6 的釋放［14］。本研究證實，NOD1 表達(dá)于胎膜組織，且在PROM組胎膜組織中NOD1表達(dá)較正常對照組升高，與羊水IL-1β及MMP3表達(dá)呈正相關(guān)，表明NOD1作為上游信號因子，可能通過直接或間接作用促進(jìn)炎性細(xì)胞因子及MMP3表達(dá)，參與胎膜破裂的發(fā)生。

人SIRT1基因位于染色體10q 21.3區(qū)域，具有一個高度保守的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的核心區(qū)域。SIRT1 兼具組蛋白及非組蛋白乙酰化酶活性，其主要功能有維持基因組穩(wěn)定、抗氧化、維持端粒的結(jié)構(gòu)與功能、調(diào)控糖和脂肪代謝、調(diào)控炎癥反應(yīng)等。在PROM患者中，感染和炎癥導(dǎo)致細(xì)胞因子、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2 和前列腺素以及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建相關(guān)酶如MMP3 激活，導(dǎo)致子宮收縮及胎膜破裂。NF-κB與上述炎性因子的激活密切相關(guān)。SIRT1 可與NF-κB 的P65 亞基K310位點結(jié)合去乙?；?，從而降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，抑制靶基因的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用［15］。另外，在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，SIRT1 可以抑制固有免疫受體如NOD 樣受體蛋白3 炎性小體激活、進(jìn)而抑制Caspase-1 裂解 及IL-1β 分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)［16］，而NOD 樣受體蛋白3 表達(dá)升高在PROM 中發(fā)揮了重要作用［17］。SIRT1在人類妊娠組織中表達(dá)且發(fā)揮作用。SIRT1在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中表達(dá)降低，與蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白協(xié)同，參與了妊娠期糖尿病患者巨大兒及體脂率異常的發(fā)生［18］。本研究結(jié)果表明，PROM 患者胎膜組織中，SIRT1 相比正常對照組表達(dá)降低，且與羊水IL-1β及MMP3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可能機(jī)制為PROM胎膜組織中SIRT1 表達(dá)減少，對NF-κB 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用抑制減弱，導(dǎo)致炎性因子表達(dá)升高。

綜上，本研究顯示，PROM 患者胎膜組織中NOD1表達(dá)升高、SIRT1表達(dá)水平降低，羊水中IL-1β及MMP3 水平升高，NOD1 與羊水IL-1β 及MMP3 表達(dá)呈正相關(guān)，SIRT1與羊水IL-1β表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由此推斷，在PROM發(fā)生發(fā)展過程中，NOD1、促炎細(xì)胞因子、MMP3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子表達(dá)水平升高及激活，而SIRT1 表達(dá)水平降低，對炎癥抑制作用減弱。減少NOD1、IL-1β 及MMP3 表達(dá)或抑制上述分子活性、增強(qiáng)SIRT1 表達(dá)或活性可能為PROM 的預(yù)防和治療提供新途徑。