基于信號(hào)增強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測(cè)三磷酸腺苷

姚 武崔 朋胡曉倩

(1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山 245041； 2.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽黃山 245041)

1 引 言

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)是基于電極反應(yīng)產(chǎn)物之間或電極反應(yīng)產(chǎn)物與體系中組分之間進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，使得發(fā)光信號(hào)分子產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，然后發(fā)光信號(hào)分子從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)而產(chǎn)生的一種光輻射，是通過(guò)電化學(xué)反應(yīng)直接或間接引發(fā)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象[1-2]。由于ECL分析技術(shù)是電化學(xué)分析和化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，兼具二者的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，因此得到了國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注，相關(guān)研究和應(yīng)用得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，特別是在檢測(cè)傳感器研究方面得到了比較廣泛的應(yīng)用。

適配體(Aptamer)是通過(guò)體外篩選、指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)獲得，可以折疊成特定三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)空間構(gòu)型互補(bǔ)以及靜電、氫鍵等作用與靶分子特異性結(jié)合的一段單鏈寡核苷酸序列(DNA或RNA)[3-5]。適配體與靶分子之間的分子識(shí)別功能與抗體抗原相似，但適配體作用的靶分子范圍更廣，且具有核酸自身穩(wěn)定性強(qiáng)、變性復(fù)性快速可逆、易功能化修飾與標(biāo)記等諸多優(yōu)點(diǎn)，已在生命、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、環(huán)境等眾多領(lǐng)域得到應(yīng)用。

近年來(lái)，人們把適配體的分子識(shí)別功能和電化學(xué)發(fā)光的信號(hào)指示功能結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建出一系列功能各異、性能優(yōu)越的電化學(xué)發(fā)光適配體型(ECL-aptamer)傳感器。該類(lèi)傳感器已被廣泛研究應(yīng)用于 miRNA[6]、蛋白[7-10]、酶[11-13]、毒素[14-16]、腫瘤細(xì)胞[17-20]、腫瘤壞死因子[21]、金屬離子[9，22]等的分析檢測(cè)。但該類(lèi)型傳感器應(yīng)用于三磷酸腺苷(ATP)的含量檢測(cè)少有報(bào)道[23-24]。ATP適配體寡核酸鏈可以顯著增強(qiáng)溶液中[Ru(bpy)2dppz]2+分子的ECL信號(hào)。當(dāng)ATP分子與適配體作用后，[Ru(bpy)2dppz]2+分子的ECL信號(hào)明顯減弱。Xu研究組[23]借助該現(xiàn)象建立了ATP含量的檢測(cè)方法，檢測(cè)限為100 nmol/L，檢測(cè)線性范圍為0.2～1.0 μmol/L。Ju小組[24]利用 ATP適配體互補(bǔ)DNA和G四鏈體DNA核酸酶雙標(biāo)記納米金顆粒。當(dāng)ATP的量越多，能夠通過(guò)與適配體雜交連接到電極表面的納米金顆粒數(shù)量就越少，DNA核酸酶催化還原溶液中作為量子點(diǎn)ECL共反應(yīng)物的溶解O2也越少，則電極表面量子點(diǎn)的ECL信號(hào)越強(qiáng)。據(jù)此建立的電化學(xué)發(fā)光適配體型傳感器用于ATP含量檢測(cè)，檢測(cè)限為7.6 nmol/L，檢測(cè)線性范圍為8～2 000 nmol/L。

本文在前期工作[25]的基礎(chǔ)上，借助納米金電極增加探針DNA(pDNA)組裝量和二茂鐵分子猝滅聯(lián)吡啶釕ECL信號(hào)，建立了一種靈敏度更高、檢測(cè)范圍更寬的電化學(xué)發(fā)光適配體型ATP檢測(cè)傳感器。兩端含6個(gè)互補(bǔ)堿基的單鏈pDNA，先通過(guò)3′分子端修飾的氨基標(biāo)記上電化學(xué)發(fā)光信號(hào)聯(lián)吡啶釕，再利用5′端修飾的巰基自組裝到納米金電極表面。電極表面的pDNA與通過(guò)5′端修飾的氨基標(biāo)記二茂鐵分子的ATP適配體雜交形成剛性線形的雙鏈DNA，從而構(gòu)建出電化學(xué)發(fā)光適配體型ATP檢測(cè)傳感器。在ATP分子與適配體作用之前，傳感器表面的pDNA與互補(bǔ)ATP適配體呈剛性線形的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使得pDNA 3′端的聯(lián)吡啶釕分子遠(yuǎn)離納米金電極表面，導(dǎo)致ECL信號(hào)較弱。同時(shí)，又由于適配體5′端標(biāo)記的二茂鐵分子對(duì)聯(lián)吡啶釕分子的電化學(xué)發(fā)光具有猝滅作用，使得此時(shí)的ECL信號(hào)更弱。當(dāng)ATP與適配體作用形成適配體-ATP復(fù)合物離開(kāi)電極表面，而后電極表面的pDNA在高離子強(qiáng)度溶液中形成發(fā)夾型的莖環(huán)構(gòu)象，使得ECL信號(hào)分子聯(lián)吡啶釕與金電極表面靠近，產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的ECL信號(hào)，如示意圖(用于ATP檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器原理圖)(a)、(b)所示。ECL信號(hào)的增強(qiáng)幅度與ATP濃度的對(duì)數(shù)值具有良好的線性關(guān)系，從而可以對(duì)ATP的含量進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，并獲得更寬的檢測(cè)范圍。如示意圖(c)所示，形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pDNA可以重新與ATP適配體雜交形成剛性線形的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，使得該傳感器具有再生性能。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑和儀器

三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、ATP適配體以及與適配體互補(bǔ)的探針DNA(pDNA)均購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)和服務(wù)有限公司。5′端氨基修飾的ATP核酸適配體堿基序列為5′-NH2-(CH2)6-GCA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-3′，其互補(bǔ)的 pDNA 序列為 5′-HS-(CH2)6-GCA CCT TCC TCC GCA ATA CTC CCC CAG GTG C-(CH2)6-NH2-3′。pDNA序列的兩端為6個(gè)互補(bǔ)的堿基，以利于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子構(gòu)象，5′端是巰基修飾，用于pDNA在納米金電極上通過(guò) Au—S鍵進(jìn)行自組裝。 二-(2，2′-聯(lián)吡啶)-4′-甲基-4-羧基聯(lián)吡啶合釕(Ⅱ)琥珀酰胺酯-二-六氟磷酸鹽(Ru(bpy)2(cbpy)NHS)購(gòu)于Fluka化學(xué)試劑公司，三-(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和 2-巰基乙醇(ME)購(gòu)于Alfa Aesar中國(guó)(天津)有限公司，三丙基胺(TPA)購(gòu)于ACROS化學(xué)試劑公司，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自百靈威化學(xué)試劑公司，二茂鐵甲酸(Fc-COOH)購(gòu)于江蘇威特化工廠。所有其他試劑均為分析純，未純化使用。

CHI660c型電化學(xué)工作站(上海晨華儀器公司)用于控制電極反應(yīng)，BPCL-2-KIC型超微弱發(fā)光分析儀(中科院北京生物物理研究所)用于電化學(xué)發(fā)光信號(hào)采集，日立U-3010型紫外分光光度計(jì)(Hitachi，Japan)用于測(cè)定紫外-可見(jiàn)光譜。

2.2 探針pDNA-Ru和aptamer-Fc的合成

按照文獻(xiàn)[26]方法合成聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的探針DNA(pDNA-Ru)和二茂鐵標(biāo)記的適配體(aptamer-Fc)，合成產(chǎn)物用紫外-可見(jiàn)光譜表征。

2.3 ECL-aptamer傳感器的構(gòu)建

金電極用α-Al2O3粉拋光成鏡面后，再分別在高純水、無(wú)水乙醇、高純水中超聲清洗，然后在0.50 mmol/L的H2SO4溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描電位為-0.2～1.7 V，掃速為0.1 V/s，直到出現(xiàn)典型且穩(wěn)定的金電極掃描特征曲線。取出金電極，用高純水清洗干凈，并用高純氮?dú)獯蹈?。該電極再在3.0 mmol/L HAuCl4(0.10 mol/L KNO3)溶液中，在-0.2 V電位下進(jìn)行恒電位電解60 s，得納米金電極。取出電極用高純水沖洗干凈后，重新在0.50 mol/L的H2SO4溶液中以相同電位范圍和掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到出現(xiàn)典型且穩(wěn)定的金電極掃描特征曲線，取出后用高純水清洗干凈，并用高純氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

將處理干凈并吹干的納米金電極迅速插入500 μL 1.0 μmol/L 的 pDNA-Ru 溶液中，在室溫下浸泡12 h，pDNA-Ru通過(guò)金硫鍵自組裝上納米金電極表面，用10.0 mmol/L的PBS(pH＝7.4)淋洗電極表面，洗去沒(méi)有鍵合的探針pDNA-Ru。該電極再在2.0 mmol/L ME(10.0 mmol/L PBS，1.0 mol/L NaCl，pH ＝7.4)溶液中浸泡鈍化1 h，除去非特異性鍵合的pDNA-Ru和封閉沒(méi)有鍵合上探針DNA的納米金電極表面位點(diǎn)。該修飾電極再浸入500 μL 0.50 μmol/L 的aptamer-Fc 溶液(10.0 mmol/L PBS，0.10 mol/L NaCl，5.0 mmol/L MgCl2，pH ＝7.4)中，于 37 ℃孵化 1 h，探針 pDNA-Ru與aptamer-Fc雜交生成剛性線形的雙螺旋DNA(ds-DNA-Ru-Fc)。所得電極用10.0 mmol/L PBS(pH＝7.4)溶液淋洗后作為ECL-aptamer傳感器待用，并用循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)阻抗譜對(duì)其進(jìn)行表征。

2.4 電化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)

ECL-aptamer傳感器在500 μL不同濃度的ATP 溶液(10.0 mmol/L PBS，0.10 mol/L NaCl，pH＝7.4)中37℃孵化40 min后，經(jīng)10.0 mmol/L PBS(pH＝7.4)緩沖溶液清洗，室溫浸泡在1.0 mol/L NaCl(10.0 mmol/L PBS，5.0 mmol/L MgCl2，pH＝7.4)溶液30 min。電極取出后用0.10 mol/L的PBS緩沖溶液淋洗電極表面，再在2.0 mL 0.10 mol/L TPA(0.10 mol/L PBS，pH ＝7.4)溶液中，于0～0.75 V電位范圍、100 mV/s掃速下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，同時(shí)記錄電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

3 結(jié)果與討論

3.1 pDNA-Ru和aptamer-Fc的表征

合成的探針pDNA-Ru用紫外-可見(jiàn)光譜進(jìn)行表征，如圖1所示。圖1中曲線a、b、c分別為探針pDNA、Ru(bpy)2(cbpy)NHS和pDNA-Ru的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。插圖是pDNA-Ru在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大，其中448 nm的吸收峰與Ru(bpy)2(cbpy)NHS的452 nm吸收峰對(duì)應(yīng)，是聯(lián)吡啶釕金屬離子到配體電子轉(zhuǎn)移的特征吸收帶，說(shuō)明聯(lián)吡啶釕已經(jīng)被標(biāo)記到探針pDNA鏈上。

圖1 pDNA(a)、Ru(bpy)2(cbpy)NHS(b)和 pDNA-Ru(c)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。插圖：pDNA-Ru在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大。注：“258(0.371 6)”含義為吸收峰波長(zhǎng)258 nm，相對(duì)于基線的吸光度值0.371 6。Fig.1 UV-Vis absorption spectra of pDNA(a)，Ru(bpy)2-(cbpy)NHS(b)and pDNA-R(c).Inset：amplification of the absorption spectrum curve of pDNA-Ru in the range of 400-500 nm.Note： “258(0.371 6)”means that the absorption peak wavelength is 258 nm，and the absorbance is 0.371 6.

合成的aptamer-Fc同樣用紫外-可見(jiàn)光譜進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。圖2中曲線a、b、c分別為aptamer、Fc-NHS和 aptamer-Fc的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。插圖是aptamer-Fc在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大，其中450 nm的吸收峰與二茂鐵琥珀酰胺酯的450 nm吸收峰對(duì)應(yīng)，說(shuō)明二茂鐵分子已經(jīng)被標(biāo)記到適配體分子上。

圖2 aptamer(a)、Fc-NHS(b)和 aptamer-Fc(c)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。插圖：aptamer-Fc在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大。注：“258(0.261 4)”含義為吸收峰波長(zhǎng)258 nm，相對(duì)于基線的吸光度值0.261 4。Fig.2 UV-Vis absorption spectra of aptamer(a)， Fc-NHS(b)and aptamer-Fc(c).Inset：amplification of the absorption spectrum curve of aptamer-Fc in the range of 400-500 nm.Note： “258(0.261 4)”means that the absorption peak wavelength is 258 nm，and the absorbance is 0.261 4.

3.2 ECL-aptamer傳感器的表征

圖3 不同階段的納米金電極在溶液中的循環(huán)伏安圖(a)和電化學(xué)阻抗圖(b)。a：裸納米金電極，b：pDNA-Ru修飾的納米金電極，c：ds-DNARu-Fc修飾的納米金電極，d：ds-DNA-Ru-Fc與ATP作用后的納米金電極。Fig.3 CV(a)and EIS(b)of the modified electrode at different stages in solution.a：bare nano-Au electrode， b： pDNA-Ru modified nano-Au electrode， c： ds-DNA-Ru-Fc modified nano-Au electrode，d：ds-DNA-Ru-Fc modified nano-Au electrode after incubation in an ATP solution.

圖3 (b)是納米金電極在不同階段的電化學(xué)阻抗曲線。納米金電極組裝探針pDNA-Ru并在ME溶液中鈍化后，電荷轉(zhuǎn)移電阻增加(圖3(b)，a和b)。當(dāng)電極表面的pDNA-Ru和aptamer-Fc雜交后，電荷轉(zhuǎn)移電阻進(jìn)一步增大(圖3(b)，c)。當(dāng)電極在ATP溶液中孵化后，電荷轉(zhuǎn)移電阻減小(圖3(b)，d)。電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化規(guī)律和循環(huán)伏安曲線的結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了pDNA-Ru在納米金電極表面的組裝、pDNA-Ru和aptamer-Fc的雜交、適配體從電極表面的解離等過(guò)程。

3.3 ECL-aptamer傳感器的電化學(xué)發(fā)光行為

圖4是ECL-aptamer傳感器與ATP分子作用前后ECL信號(hào)的變化過(guò)程。曲線a表明裸納米金電極沒(méi)有ECL信號(hào)產(chǎn)生，組裝了pDNA-Ru并在ME溶液中鈍化后，pDNA-Ru形成發(fā)夾型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使得聯(lián)吡啶釕分子靠近電極表面，產(chǎn)生很強(qiáng)的ECL信號(hào)(圖4，b)。該修飾電極在0.50 μmol/L aptamer-Fc溶液中37℃孵化1 h，pDNARu和aptamer-Fc雜交形成剛性線形的雙螺旋DNA鏈(ds-DNA-Ru-Fc)，由于 pDNA 3′端標(biāo)記的聯(lián)吡啶釕分子遠(yuǎn)離納米金電極表面，且適配體5′端標(biāo)記的二茂鐵分子靠近聯(lián)吡啶釕分子，對(duì)聯(lián)吡啶釕的ECL信號(hào)具有猝滅作用，導(dǎo)致ECL信號(hào)顯著降低(圖4，c)。當(dāng)ECL-aptamer傳感器浸泡在100.0 nmol/L ATP溶液中，由于ATP分子與適配體分子存在更強(qiáng)的相互作用，生成適配體-ATP復(fù)合物，aptamer-Fc從電極表面脫落，消除了二茂鐵分子對(duì)聯(lián)吡啶釕ECL信號(hào)的猝滅作用，導(dǎo)致ECL信號(hào)增強(qiáng)(圖4，d)。此時(shí)的ECL-aptamer傳感器再在高離子強(qiáng)度溶液(1.0 mol/L NaCl，10.0 mmol/L PBS，5.0 mmol/L MgCl2，pH ＝ 7.4)中作用30 min，單鏈 pDNA-Ru再次形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，ECL信號(hào)基本恢復(fù)至與aptamer-Fc雜交之前的強(qiáng)度水平(圖 4，e)。

圖4 ECL-aptamer傳感器在不同階段的ECL發(fā)光曲線。a：裸納米金電極，b：pDNA-Ru修飾的納米金電極，c：ds-DNA-Ru-Fc 修飾的納米金電極，d：ds-DNA-Ru-Fc與ATP作用后的納米金電極，e：在1.0 mol/L氯化鈉溶液中孵化后的納米金電極。Fig.4 ECL profiles of the ECL-aptamer biosensor at different stages.a： bare nano-Au electrode， b： pDNA-Ru modified electrode， c： ds-DNA-Ru-Fc modified electrode； d： ds-DNA-Ru-Fc modified electrode after incubation in an ATP solution， e： resulting electrode incubated in 1.0 mol/L NaCl solution.

3.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)研究了探針pDNA-Ru自組裝時(shí)間對(duì)ECL信號(hào)的影響，結(jié)果如圖5所示。隨著自組裝時(shí)間的延長(zhǎng)，ECL信號(hào)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)自組裝時(shí)間為12 h時(shí)達(dá)到最大，而組裝時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，反而使ECL信號(hào)明顯減弱。故實(shí)驗(yàn)選用12 h作為自組裝時(shí)間。

圖5 pDNA-Ru自組裝時(shí)間對(duì)ECL強(qiáng)度的影響Fig.5 Dependence of the ECL intensity on the self-assembly time of pDNA-Ru

圖6 電解電位范圍對(duì)ECL強(qiáng)度和重復(fù)性的影響Fig.6 Dependence of the ECL intensity and reproducibility on the applied potential

實(shí)驗(yàn)考察了不同電解電位范圍對(duì)ECL信號(hào)強(qiáng)度和重復(fù)性的影響，結(jié)果如圖6所示。電位范圍在0～0.75 V時(shí)，產(chǎn)生的信號(hào)較強(qiáng)，連續(xù)測(cè)定3次，信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定。故實(shí)驗(yàn)選用0～0.75 V的循環(huán)伏安電解電位范圍。

實(shí)驗(yàn)也考察了ECL-aptamer傳感器與ATP的相互作用時(shí)間對(duì)傳感器電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響，結(jié)果如圖7所示。隨著相互作用時(shí)間從10 min增加到30 min，發(fā)光信號(hào)逐漸增大。作用時(shí)間達(dá)到40 min后，發(fā)光信號(hào)基本保持穩(wěn)定。故實(shí)驗(yàn)選用40 min作為相互作用時(shí)間。

圖7 ECL-aptamer傳感器與ATP的作用時(shí)間對(duì)傳感器電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響Fig.7 Dependence of the ECL decreased intensity of the ECL-aptamer sensor on the interaction time with ATP

3.5 ATP的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

圖8 ECL-aptamer傳感器在不同濃度ATP溶液孵化后的ECL曲線。 ATP 溶液濃度為：a ～ f：0，0.01，0.10，1.0，10.0，100.0 nmol/L。 插圖：ECL 信號(hào)強(qiáng)度與ATP濃度對(duì)數(shù)值之間的線性曲線。Fig.8 ECL profiles for the ECL-aptamer biosensors after incubated in ATP solutions with different concentrations.Inset：the calibration curve of the dependence of ECL intensity on the logarithm of different concentrations of ATP.The concentrations of ATP were(from a to f)0，0.01，0.10，1.0，10.0，100.0 nmol/L.

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，與不同濃度的ATP相互作用后，ECL-aptamer傳感器會(huì)產(chǎn)生不同強(qiáng)度的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。如圖8所示，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度隨ATP濃度的增大而增加，且與ATP濃度的對(duì)數(shù)值在10.0 pmol/L～100.0 nmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為IECL＝201+672.8 lgC(C單位為pmol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.995 9，檢測(cè)限達(dá)到5.0 pmol/L。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，可以檢測(cè)到500 μL溶液中5.0 fmol的ATP。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果比較，該ECL-aptamer傳感器具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，如表1所示。

表1 不同檢測(cè)方法的線性范圍和檢測(cè)限Tab.1 Linear ranges and detection limits of different detection methods

3.6 ECL-aptamer傳感器的選擇性和再生性

為考察該ECL-aptamer傳感器對(duì)ATP的選擇性響應(yīng)，進(jìn)行了傳感器對(duì)CTP(ATP的類(lèi)似物)的響應(yīng)實(shí)驗(yàn)。同樣條件下，該傳感器分別在空白溶液、0.10 nmol/L ATP、0.10 nmol/L CTP 和 0.10 nmol/L混合溶液(ATP/CTP)中的孵化，并測(cè)量ECL信號(hào)。從圖9結(jié)果中可以看出，只有ATP組分使得ECL-aptamer傳感器產(chǎn)生了明顯的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)，說(shuō)明該傳感器對(duì)ATP具有良好的選擇性。

圖9 ECL-aptamer傳感器分別在空白溶液、CTP溶液、ATP溶液和混合溶液(CTP/ATP)中孵化后的ECL信號(hào)強(qiáng)度比較。Fig.9 Comparison of the ECL intensity of the ECL-aptamer biosensor when incubated with blank，CTP，ATP and mixed-sample(CTP/ATP).

實(shí)驗(yàn)也考察了傳感器再生使用的性能。傳感器用于檢測(cè)100.0 nmol/L ATP溶液后，用10.0 mmol/L的PBS(pH＝7.4)淋洗電極表面，再浸入500 μL 0.50 μmol/L 的 aptamer-Fc 溶液(10.0 mmol/L PBS， 0.10 mol/L NaCl， 5.0 mmol/L MgCl2，pH＝7.4)中，于37℃孵化1 h。 所得電極又重新用于100.0 nmol/L ATP溶液的檢測(cè)，ECL信號(hào)可以恢復(fù)到原來(lái)的90%。區(qū)別于其他類(lèi)型的傳感器，該傳感器的再生不需要高溫過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器具有較好的再生性能。

4 結(jié) 論

本文基于ATP適配體與ATP分子作用后可以顯著增強(qiáng)傳感器ECL信號(hào)的性能，利用與ATP適配體完全互補(bǔ)且標(biāo)記聯(lián)吡啶釕的DNA作為傳感探針，適配體作為識(shí)別元件，構(gòu)建了一種電化學(xué)發(fā)光適配體型傳感器。該傳感器用于ATP含量的檢測(cè)，檢測(cè)限為5.0 pmol/L，檢測(cè)線性范圍為10.0～1.0×105pmol/L，與已報(bào)道結(jié)果相比具有更低的檢測(cè)限和更寬的檢測(cè)范圍。該傳感器構(gòu)建方法為其他基于適配體的電化學(xué)發(fā)光傳感器構(gòu)建提供了參考。