Rac1 在慢性應(yīng)激抑郁大鼠中的作用及機制

包玲 張新風(fēng) 丁佩

(1武漢市精神衛(wèi)生中心精神科，湖北 武漢 430022；2荊州市精神衛(wèi)生中心精神科)

抑郁癥是世界常見的精神疾病之一，其特點是患者情緒障礙，具有自殺傾向〔1～3〕。抑郁癥是一種嚴重疾病，其終生患病率為15%〔4〕。抑制癥的發(fā)生嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，而目前對于抑制癥有效的治療手段十分有限，僅有三分之一的患者可以從當下的抗抑郁治療中獲利〔5,6〕。另一方面，近幾十年來并沒有真正的新型抗抑郁藥進入市場〔6〕。因此需要進一步了解抑郁癥的詳細機制，以鑒定出新的有效的治療目標。臨床和基礎(chǔ)研究表明，抑郁癥的發(fā)生伴隨著大腦結(jié)構(gòu)的異常，如腦體積變小以及突觸的功能和數(shù)目降低〔7〕。 Ras相關(guān)的C3 肉毒素底物(Rac)1是小G蛋白Rho GTPase家族的一員，是細胞骨架的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與突觸可塑性密切相關(guān)〔8〕。同時，Rac1 在神經(jīng)元發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)樹突棘和興奮性突觸的形成〔9,10〕。此外當Rac1 功能紊亂時則會引起小鼠的認知功能障礙〔11〕。這些研究表明Rac1可能在抑郁中發(fā)揮重要作用，而目前國內(nèi)對于Rac1在抑郁癥中的研究卻較少，對于其作用及機制尚不清楚。因此本研究通過構(gòu)建大鼠慢性應(yīng)激(CUMS)抑郁模型，探究Rac1在抑郁癥呂的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，8周齡SD大鼠；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀購自德國Eppendorf公司；Step-one 實時熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)自美國Applied Biosystems 公司；Rac1過表達病毒購自吉凱基因；RT-PCR引物購自Invitrogen；抗突觸素(SYP)、突觸后致密蛋白(PSD)95、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、GAPDH抗體購自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1腦微注射過表達Rac1慢病毒 用1%的戊巴比妥麻醉大鼠并固定在腦立體定位儀上，剪開頭皮，腦微注射Rac1過表達慢病毒。在注射病毒后1 w，進行CUMS造模。4 w后進行行為學(xué)檢測。對照組大鼠腦微注射對照病毒(Rac1 con)。伏隔核坐標(前囟前1.5 mm，中線外側(cè)±1.0 mm，深度5.9 mm)。 實驗分為：對照+Rac1 con組，對照+Rac1組，模型+Rac1 con組，模型+Rac1組。每組10只。

1.2.2慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激大鼠抑郁模型(CUMS)建立 將大鼠隨機給予強迫游泳，冰水浴，夾尾，晝夜顛倒，食物和水的剝奪，閃光刺激等，持續(xù)4 w。

1.2.3糖水偏好實驗(SPT) 實驗前，大鼠禁食禁水，用兩瓶1%蔗糖溶液使大鼠適應(yīng)環(huán)境。24 h后，用自來水替換其中一個瓶子。在測試時，單獨飼養(yǎng)大鼠，并給予大鼠200 ml自來水和200 ml 1%蔗糖溶液各1瓶。12 h換1次位置，24 h收取糖水瓶和自來水瓶。百分比(蔗糖攝入量/蔗糖攝入量加水攝入量)表示為糖水偏好(SP)。

1.2.4礦場實驗(OFT) OFT可用于評估動物的運動活動和情緒反應(yīng)。礦場為120 cm×90 cm×35 cm不透明敞箱。礦場底部被分成25個方格，其中外圍場地由外圍16個方格組成，中間9個方格被認為是中心區(qū)。測試時保持安靜，將每只大鼠單獨放入礦場的角落并使其自由探索5 min。通過行為視頻分析大鼠在中央?yún)^(qū)活動距離和中心區(qū)停留時間。

1.2.5強迫游泳實驗(FST) FST評估動物的絕望程度。實驗時，每只大鼠置于垂直有機玻璃圓筒(45 cm高×20 cm直徑)中，水溫(25±1)℃，深度30 cm。記錄5 min內(nèi)的不動時間以供分析。結(jié)束后將大鼠從水中取出，用毛巾擦干，然后放回干凈的籠中。

1.2.6實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測RAC1表達 Rac1引物序列為正向：5′-GCAAACAGATGTGTTCTTAAT-3′，反向：5′-TCATCCCTAAGATCAAGTTT-3′。β-actin作為內(nèi)參，其引物序列為正向：5′-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3′，反向：5′-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3′。大鼠麻醉后灌流取材，采用Trizol法提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測大鼠伏隔核區(qū)Rac1 mRNA的表達。

1.2.7Western印跡 用RIPA裂解液在冰上裂解組織樣本，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。蛋白樣品加入上樣緩沖液稀釋，沸水浴5 min。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次15 min，室溫孵育二抗(1∶2 000)2 h；用TBST洗3次，每次15 min。用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，拍照統(tǒng)計。

1.3統(tǒng)計分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Rac1 在CUMS大鼠伏隔核中表達降低 模型組Rac1 mRNA表達水平(0.55±0.14)顯著低于對照組(0.98±0.21，P<0.001)。

2.2過表達Rac1緩解CUMS大鼠的抑郁樣行為 與對照+Rac1 con 組相比，模型+Rac1 con 組SP顯著降低，F(xiàn)ST不動時間顯著增加，OFT在中央?yún)^(qū)活動距離和時間顯著縮短(均P<0.001)。與模型+Rac1 con組相比，模型+Rac1組SP顯著升高，F(xiàn)ST不動時間顯著縮短，OFT在中央?yún)^(qū)活動距離和時間顯著延長(均P<0.001)。見表1。

2.3過表達Rac1 增加CUMS大鼠SYP及PSD95 蛋白的表達 與對照+Rac1 con 組相比，模型+Rac1 con 組SYP、PSD95 蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)，與模型+Rac1 con 相比，模型+Rac1組SYP，PSD95 蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)。見表1、圖1。

表1 各組行為學(xué)變化及SYP、PSD95、GFAP蛋白表達

圖1 Western印跡檢測SYP及PSD95蛋白表達

2.4過表達Rac1增加CUMS大鼠GFAP的表達 與對照+Rac1 con 組相比，模型+Rac1 con 組GFAP蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)，與模型+Rac1 con 相比，模型+Rac1組GFAP蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)。見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測GFAP表達

3 討 論

抑郁癥與調(diào)節(jié)情緒和認知的大腦區(qū)域的體積減小及這些區(qū)域神經(jīng)元突觸的減少有關(guān)〔12〕。阻止或逆轉(zhuǎn)這些神經(jīng)元功能障礙可以達到抗抑郁的目的。Rac1可以調(diào)節(jié)多種神經(jīng)元功能諸如細胞骨架動力學(xué)，軸突生長和導(dǎo)向，細胞存活，樹突分支，棘形態(tài)，興奮性突觸形成及突觸可塑性等〔8,13〕。已經(jīng)證實Rac1參與幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生如精神分裂癥〔14〕，阿爾茨海默病〔15〕等。在抑郁癥中，Golden等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型小鼠和抑郁癥患者死后伏隔核中RAC1的表達降低。本研究結(jié)果表明Rac1在慢性應(yīng)激大鼠抑郁樣行為發(fā)生中具有重要作用。

SYP是一種鈣結(jié)合糖蛋白，廣泛分布在神經(jīng)突觸前膜的囊泡中。它被認為是突觸前末端的特異性標記蛋白。它的表達可以準確反映突觸的密度，分布區(qū)域和功能狀態(tài)〔17〕。PSD95是位于突觸后膜的特異性分子，通過與相應(yīng)受體或信號分子相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)元及突觸生成和可塑性，神經(jīng)遞質(zhì)及其他神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成〔18〕。SYP和PSD95的表達水平可以用來反映突觸形態(tài)及生物功能的改變〔19〕。本研究結(jié)果表明過表達Rac1的在慢性應(yīng)激大鼠中的抗抑郁作用通過促進伏隔核神經(jīng)元和突觸生成發(fā)揮作用。

星形膠質(zhì)細胞具有支持營養(yǎng)神經(jīng)元的作用。研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞障礙與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)?；加兄囟纫钟舭Y(MDD)的患者和抑郁癥動物模型中GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量或密度減少〔20〕。Rac1 與星形膠質(zhì)細胞骨架重排和形態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)。Rac1特異性shRNA轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞可以抑制星狀星形膠質(zhì)細胞的生長和成熟〔21,22〕。因此，Rac1表達降低可能是抑郁癥中星形膠質(zhì)細胞功能障礙的原因之一。本研究結(jié)果表明過表達Rac1可以抑制慢性應(yīng)激抑郁大鼠中星形膠質(zhì)細胞的丟失。星形膠質(zhì)細胞的恢復(fù)可以促進神經(jīng)保護作用，從而緩解大鼠抑郁樣行為。