駱駝瘤胃乳酸菌的分離、鑒定及其降解吲哚的功能研究

朱雅琴,黃煦杰,江 巖,李佳雯,劉蔓萩,曾獻(xiàn)春,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046;2.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院,四川成都 610500)

吲哚是吡咯與苯并聯(lián)的化合物,稱苯并吡咯,屬于含氮雜環(huán)化合物。吲哚分子式為C8H7N,難溶于水,易溶于50%～100%乙醇、異丙醇及二氯甲烷等有機(jī)溶劑。吲哚及其衍生物在自然界分布廣泛,存在于天然有機(jī)物、溫血動物腸道、糞便和煤焦油中[1-2]。吲哚作為腸道毒素,當(dāng)腸道菌群微生態(tài)環(huán)境被內(nèi)外因素破壞,腐敗菌和致病菌大量繁殖且分解食物、膽汁可以產(chǎn)生吲哚[3],其在體內(nèi)長期蓄積將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病理變化,如引發(fā)炎癥、損傷結(jié)腸、損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟[4]。吲哚也可以協(xié)同致癌,通過亞硝酸鹽促進(jìn)次生胺的亞硝化作用,起到癌癥促進(jìn)劑的作用,具有致畸、致突變性,對環(huán)境和機(jī)體造成危害,已日益引起人們的關(guān)注[5]。目前獲得的降解吲哚的微生物,主要來自被污染的環(huán)境,其中以不動桿菌、假單胞菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、伯克霍氏菌和羅爾斯通菌屬微生物最多[6]。羅海恩從焦化廠兼氧池水樣分離得到芽孢桿菌L1對吲哚和喹啉的降解率高達(dá)74.4%[7],楊冰玉等從近海泥沙樣品分離得到的產(chǎn)堿桿菌YBY,其可在14 h內(nèi)降解100 mg/L吲哚[8]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是人及動物腸道中極為重要的菌群之一,對人、畜機(jī)體均有益。腸道中的乳酸菌依靠腸道黏附進(jìn)行營養(yǎng)代謝,發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[9],大量研究證實乳酸菌作為益生菌具有降解有害物質(zhì)如吲哚[10]、3-甲基吲哚[11]、亞硝酸鹽[12-14]、苯并芘[15-16]、雜環(huán)胺[17]和多種霉菌毒素[18-19]等功能,其具有降解和轉(zhuǎn)化腸道內(nèi)有害物質(zhì)[20]、清除致病毒素、維持腸道平衡的作用。乳酸菌降解有害物質(zhì)的機(jī)制主要是其可產(chǎn)生分解有機(jī)物、脂肪酸、亞硝胺、內(nèi)毒素的特殊酶系[21]。高鵬飛等[22]研究發(fā)現(xiàn)，以益生乳酸菌植物乳桿菌P-8飼喂肉雞,試驗組肉雞糞便中吲哚含量顯著低于對照組(P<0.05)。并且有報道研究表明肉雞盲腸或直腸微生物組成的體外發(fā)酵液,隨著乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的增加導(dǎo)致吲哚和糞臭素的水平降低[23]。

駱駝(Camelusbactrianus)是新疆特色養(yǎng)殖家畜,能夠在極端干旱、鹽堿的環(huán)境中生長[24]。作為典型的荒漠動物,駱駝攝入狼毒、駱駝蓬、假木賊等有毒的野生植物卻不會中毒,其原因主要依賴駱駝消化道中的微生物能夠降解、清除這些植物毒素,前期研究發(fā)現(xiàn)植物毒素結(jié)構(gòu)與雜環(huán)化合物基本結(jié)構(gòu)相似[25],推測駱駝消化道微生物可以降解含氮雜環(huán)化合物。目前,對駱駝瘤胃微生物的研究主要集中在菌落多樣性及木質(zhì)纖維素降解能力方面,而對吲哚降解研究甚少。有研究發(fā)現(xiàn)駱駝瘤胃和腸道微生物能夠降解雜環(huán)化合物[26],從駱駝瘤胃內(nèi)容物分離得到的乳桿菌屬對駱駝蓬有降解作用[27],對雜環(huán)化合物吡啶的降解率在108 h內(nèi)達(dá)到100%[28]。Mohammed等[29]也報道了山羊瘤胃微生物對吲哚及其化合物有一定的降解能力。

因此本研究從駱駝瘤胃中分離、純化菌株，獲得乳酸菌,并在體外開展乳酸菌降解吲哚的研究,通過GC-MS定時定量測定乳酸菌對吲哚的降解量,了解其降解能力,獲得高效降解吲哚的乳酸菌,為進(jìn)一步拓展乳酸菌的益生功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙峰駱駝瘤胃內(nèi)容物 烏魯木齊市屠宰場提供;吲哚標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純,Aladdin試劑有限公司;二氯甲烷 分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) Agilent;U-3010紫外-可見分光光度計 Hitachi公司;PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀 加拿大BBI公司;凝膠成像系統(tǒng) Gene Genius公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

MRS固體培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g,牛肉浸膏15.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母浸膏5.0 g,無水乙酸鈉5.0 g,磷酸二氫鉀2.62 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,七水硫酸鎂0.58 g,四水硫酸錳 0.198 g,瓊脂粉 20 g,吐溫-80 1.0 mL,無菌水1000 mL,pH6.0～6.5,121 ℃滅菌20 min。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基:磷酸氫二鈉4.26 g,磷酸二氫鉀2.65 g,硝酸銨1 g,七水硫酸鎂0.2 g,氯化鈣0.02 g,七水硫酸亞鐵0.01 g,七水硫酸錳0.002 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,酵母浸出粉5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

1.3 駱駝瘤胃內(nèi)容物中乳酸菌的篩選

1.3.1 乳酸菌的初篩 無菌采集烏魯木齊市屠宰場3頭駱駝瘤胃內(nèi)容物,用無菌生理鹽水倍比稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8,分別吸取每個稀釋度溶液100 μL,涂布接種于MRS固體培養(yǎng)基,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取表面光滑、凸圓、邊緣完整、顏色呈乳白色的單菌落,反復(fù)進(jìn)行分離純化2～3次后,挑取疑似乳酸菌生長特征的菌落進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3.2 乳酸菌的復(fù)篩 將初篩得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶實驗,對革蘭氏陽性、接觸酶陰性菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1 提取菌株總DNA、PCR擴(kuò)增及菌種鑒定 使用OMEGA土壤DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA,根據(jù)細(xì)菌通用引物16S rDNA 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)設(shè)計通用引物[30]。反應(yīng)體系總體積為50 μL,10×Taq Buffer(含Mg2+)5 μL,DNA模板2 μL,d NTPs 5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,Ex-Taq酶0.75 μL,ddH2O 35.25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min預(yù)變性;94 ℃ 45 s;55 ℃ 45 s;72 ℃ 75 s;35個循環(huán),72 ℃延伸10 min。

1.4.2 建立系統(tǒng)發(fā)育樹 得到的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,再使用SuPrep凝膠DNA提取試劑盒進(jìn)行純化后測序。將各菌的16S rDNA測序結(jié)果申請登錄號后,與GenBank上所提交的細(xì)菌序列進(jìn)行比對,通過Blast功能篩選出同源性較高的菌,用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[27]。

1.5 駱駝瘤胃乳酸菌對吲哚降解能力的測定

1.5.1 駱駝瘤胃乳酸菌降解吲哚實驗 將篩選得到的4株乳酸菌接種至MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化后的乳酸菌接種到LB培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的菌液于4000 r/min離心5 min,收集沉淀,用無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌3次,收集沉淀,加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基制成吸光度值(600 nm)為2的菌懸液。以接種量5%將菌懸液接種到以吲哚為唯一碳源、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng),每株菌有三個平行實驗。每隔12 h取樣測定乳酸菌的吸光度值(600 nm)和吲哚殘留量,繪制乳酸菌生長曲線和降解曲線。

1.5.2 吲哚的萃取 每隔12 h從無機(jī)鹽培養(yǎng)基中吸取菌液 5 mL,加入二氯甲烷5 mL,用超聲波混勻后,靜置過夜,收集下層二氯甲烷萃取液[31]。

1.5.3 吲哚含量的測定

1.5.3.1 GC-MS條件 GC條件:色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm);載氣:氦氣(99.999%);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣;分流比:50∶1;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;程序升溫:初始溫度40 ℃,保持0.5 min,再以20 ℃/min的速度升溫到110 ℃。后運行240 ℃,保持1 min。MS條件:離子源溫度:230 ℃;接口溫度:280 ℃;四極桿:150 ℃;電子轟擊能量:70 eV;溶劑延遲時間:2.1 min;掃描方式:全掃描模式,因排除有雜峰干擾的可能性,定性掃描范圍為20～550 m/z。質(zhì)譜庫:NIST2011。

1.5.3.2 定性方法 根據(jù)吲哚標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖中的出峰時間進(jìn)行定性。

1.5.3.3 定量方法 吲哚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:配制吲哚濃度為400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,加入適量的二氯甲烷,配制25、50、100、300、400 mg/L五個濃度,分別進(jìn)樣后,以濃度為橫坐標(biāo),定性離子(m/z,117.1)的峰面積為縱坐標(biāo),求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,以此計算被測樣品中吲哚的殘留量。

1.5.4 吲哚降解率的計算 收集1 μL二氯甲烷萃取液注入GC-MS聯(lián)用儀,測定無機(jī)鹽培養(yǎng)基中吲哚殘留量,了解菌株對吲哚的降解能力。降解率計算見公式(1)。

式(1)

式中:R1,吲哚降解率,%;A,吲哚初始量,mg/L;B,吲哚殘留量,mg/L。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2013軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單處理后,利用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌初步篩選

挑取MRS固體培養(yǎng)基中表面光滑、凸圓、邊緣完整、顏色呈乳白色的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色,于油鏡下觀察,結(jié)果如圖1。四株菌染色后均呈紫色,為革蘭氏陽性菌,菌體為短桿狀,兩端鈍圓,無芽孢,無鞭毛。過氧化氫酶試驗陰性,初步確定為乳酸菌。

圖1 顯微形態(tài)圖Fig.1 The morphology by microscope注:A～D分別為GU366027、GU366034、GU366021、GU366019的顯微形態(tài)圖(1000×)。

2.2 乳酸菌的鑒定

對菌的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,得到的片段長度約1500個堿基對,電泳檢測擴(kuò)增片段,結(jié)果見圖2。將獲得的4株乳酸菌的16S rDNA序列向GenBank申請,并獲得登錄號,登錄號為GU366019、GU366021、GU366027、GU366034。將16S rDNA測序結(jié)果與GenBank 中BLAST比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖3。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,GU366019、GU366027、GU366021、GU366034均歸屬為乳桿菌屬,其中GU366019、GU366027、GU366021為德氏乳桿菌亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.),GU366034為馴馬乳桿菌(Lactobacillusequicursoris)。

圖2 菌株GU366019、GU366021、GU366027、GU366034的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification of stains GU366019,GU366021,GU366027 and GU366034

圖3 菌株GU366019、GU366021、GU366027、GU366034的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains GU366019,GU366021,GU366027 and GU366034

2.3 吲哚的定性

根據(jù)GC-MS結(jié)果可知標(biāo)準(zhǔn)樣品吲哚的保留時間即出峰時間為:3.732 min,見圖4。在定性質(zhì)量范圍為(m/z)20～550,參照NIST2011標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫確定吲哚的定性離子質(zhì)荷比(m/z)為117.1、90.1、63.1,見圖5。由圖6可知,菌株GU366027、GU366034、GU366021、GU366019在降解吲哚實驗中,培養(yǎng)96 h時色譜圖中出峰時間分別為3.733、3.738、3.739、3.735 min,與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相近,因此可判定出峰時間3.732 min左右的峰面積為無機(jī)鹽培養(yǎng)基中吲哚殘留量。

圖5 吲哚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of indole standard sample

圖6 四株菌降解吲哚實驗96 h時的色譜圖Fig.6 Chromatogram of indole degradation of four strains at 96 h 注:A～D分別為菌株GU366027、GU366034、GU366021、GU366019降解吲哚時的色譜圖。

圖4 吲哚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Chromatograms of indole standard sample

2.4 吲哚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及回收率測定

制定吲哚標(biāo)準(zhǔn)曲線,以峰面積為縱坐標(biāo),其濃度為橫坐標(biāo),求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,曲線方程:y=6473.1x+22254(y是面積,x是濃度),R2=0.9997,見圖7。并采用標(biāo)樣加入法測定回收率,將吲哚標(biāo)準(zhǔn)品測定量與吲哚標(biāo)準(zhǔn)品加入量的比值作為回收率結(jié)果,平均加樣回收率為91.33%～108.48%。

圖7 吲哚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of indole

2.5 駱駝瘤胃乳酸菌對吲哚的降解能力研究

通過紫外分光光度計測定OD600,得到菌株生長曲線;使用GC-MS測定吲哚的殘留量,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算吲哚的降解率,結(jié)果見圖8。四株乳酸菌接種到以吲哚(500 mg/L)為唯一氮源、碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基后,由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏,菌體總體生長緩慢,當(dāng)菌體逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境后,GU366027、GU366034、GU366019、GU366021都可以將培養(yǎng)基中的吲哚作為碳源、氮源加以利用,促進(jìn)菌體生長繁殖,在培養(yǎng)過程中,菌株對吲哚的降解情況詳見表1。由表1和圖8可知,培養(yǎng)初期(24 h)四株菌就開始利用吲哚,GU366027、GU366019、GU366021對吲哚的降解率達(dá)到30%左右,GU366034為17%。隨著培養(yǎng)時間的延長,菌株的數(shù)量不斷增加的同時,吲哚的降解率也不斷增加,在培養(yǎng)中期(72 h),GU366019、GU366021降解率超過50%,這兩株菌在培養(yǎng)120 h時的降解率超過80%。培養(yǎng)后期(144 h),GU366019、GU366021、GU366027已經(jīng)將培養(yǎng)基中的吲哚完全降解?？傮w來說GU366034在整個培養(yǎng)過程中對吲哚的降解速率相對較慢,在120 h時降解率是53%,到156 h時降解率達(dá)到100%,其在培養(yǎng)后期降解效率高。GU366019、GU366021、GU366027三株菌對培養(yǎng)基中的吲哚降解速率高,培養(yǎng)前期降解能力強(qiáng)。實驗結(jié)果顯示了四株來源于駱駝瘤胃的乳酸菌對高濃度的吲哚有較強(qiáng)的耐受及降解能力。

表1 GU366027、GU366034、GU366019、GU366021對吲哚的降解率Table 1 Degradation rate of indole by GU366027,GU366034,GU366019 and GU366021

圖8 乳酸菌生長曲線及降解吲哚曲線Fig.8 The growth curve and indole degradation curve of lactic acid bacteria注:A～D分別為GU366027、GU366034、GU366021、GU366019的生長曲線和吲哚降解曲線。

目前已經(jīng)獲得了許多具有吲哚降解能力的細(xì)菌,主要來源于被污染的環(huán)境,例如石油污染的土壤、焦化廠的兼氧池水樣、污水處理廠的污泥等[7,32-33],而來源于動物消化道的乳酸菌降解吲哚的相關(guān)研究較少。本實驗篩選得到的四株乳酸菌來源于駱駝瘤胃,體外可耐受并降解利用高濃度的吲哚。作為乳酸菌與來源于污染環(huán)境中的微生物相比,在污染物處理和腸道毒素降解過程中具有一定的安全性。后期實驗將對降解菌開展育種和培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究,縮短降解時間,提高降解效率,希望能用于腸道毒素和環(huán)境污染物的降解。

3 結(jié)論

本研究從駱駝瘤胃中分離篩選得到四株乳酸菌:GU366019、GU366027、GU366021、GU366034均歸屬為乳桿菌屬,其中GU366019、GU366027、GU366021為德氏乳桿菌亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.),GU366034為馴馬乳桿菌(Lactobacillusequicursoris)。通過體外吲哚降解能力測定,四株乳酸菌對高濃度(500 mg/L)的吲哚降解率達(dá)到100%。本研究拓展了動物消化道微生物的應(yīng)用范圍,擴(kuò)充了降解吲哚的微生物資源,乳酸菌的相對安全性將避免應(yīng)用過程中對環(huán)境和機(jī)體產(chǎn)生危害。本研究為后期開展乳酸菌降解吲哚的機(jī)制及治理環(huán)境污染物的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ),為乳酸菌降解腸道毒素研究提供實驗方法和理論依據(jù)。