貴州省新型冠狀病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量現(xiàn)場(chǎng)考核結(jié)果分析

吳 嫻，馮勤穎，向 麗，黃 山，王濟(jì)林，孫建超，陶永德

貴州省臨床檢驗(yàn)中心，貴州貴陽(yáng) 550002

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的，確診的金標(biāo)準(zhǔn)是可在患者體內(nèi)檢測(cè)到SARS-CoV-2，而核酸檢測(cè)是檢測(cè)病毒基因中的某些特定核酸序列，因此從方法學(xué)層面考慮可將其作為實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)[1]。ZHU等[2]在2020年1月通過(guò)高通量測(cè)序已證實(shí)SARS-CoV-2為一種β屬冠狀病毒，其基因組約含29 000個(gè)堿基，有12個(gè)蛋白編碼區(qū)/開放讀碼框(ORF)，包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14；其中ORF 1ab編碼RNA聚合酶，可參與病毒核酸復(fù)制；N區(qū)編碼核殼蛋白，其與病毒基因組宿主RNA互相識(shí)別；E區(qū)編碼囊膜蛋白，與病毒包膜及病毒顆粒的形成相關(guān)[3-4]。

近期，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性率問(wèn)題備受社會(huì)關(guān)注。貴州省為了切實(shí)做好“外防輸入、內(nèi)防擴(kuò)散”工作，及時(shí)有效發(fā)現(xiàn)和控制傳染源，規(guī)定了對(duì)五類人員(疑似病例、確診病例的密切接觸者、每天發(fā)熱門診就診的發(fā)熱患者、湖北省武漢市等地返黔的居家隔離和集中隔離人員、每天由湖北省武漢市等地新來(lái)黔或返黔人員)開展全面核酸檢測(cè)。貴州省衛(wèi)生健康委員會(huì)在原來(lái)的10家疾控中心檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)上，新增21家醫(yī)療機(jī)構(gòu)和3家第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，作為全省SARS-CoV-2核酸檢測(cè)指定實(shí)驗(yàn)室，共計(jì)34家。為保證檢測(cè)結(jié)果，了解各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力以及檢測(cè)試劑的質(zhì)量狀況，貴州省臨床檢驗(yàn)中心針對(duì)省內(nèi)34家SARS-CoV-2核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了技術(shù)考核，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料和方法

1.1材料 本次考核品定制于相關(guān)生物制品公司，共有10批考核品，包括陰性、弱陽(yáng)性和陽(yáng)性樣品。陰性樣品為稀釋液；陽(yáng)性樣品采用裝甲R(shí)NA技術(shù)，將3個(gè)目標(biāo)RNA序列(含ORF 1ab、N和E基因)用噬菌體蛋白外殼加以包裹形成，其結(jié)構(gòu)類似于天然病毒，以還原真實(shí)的樣品，然后進(jìn)行培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液，對(duì)收獲的假病毒培養(yǎng)液進(jìn)行初步定值，然后用陰性稀釋液稀釋至所需水平；弱陽(yáng)性樣品病毒拷貝數(shù)為所用6種試劑盒檢測(cè)限均值的3～5倍。陽(yáng)性樣品大約為105拷貝/毫升，規(guī)格:1.0 毫升/管。所用考核樣品由專人按照冷藏條件送到各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，在事先不通知的情況下，在規(guī)定時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)和回報(bào)。

1.2方法

1.2.1試劑盒 本次考核一共涉及6個(gè)不同廠家生產(chǎn)的國(guó)產(chǎn)試劑盒，分為A～F 6組，其中A～E組檢測(cè)位點(diǎn)為ORF 1ab和N基因，F(xiàn)組除這2個(gè)基因外，還檢測(cè)E基因，6種試劑中，除一種使用一步法外，其余均用磁珠法進(jìn)行病毒核酸提取，且6種試劑均采用熒光定量PCR法對(duì)靶基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2檢測(cè)方法 各實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第二版)》[5]和《國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南(第二版)的通知》[6]相關(guān)文件進(jìn)行生物安全防護(hù)和實(shí)驗(yàn)操作，并嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行RNA的提取及擴(kuò)增檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1各檢測(cè)機(jī)構(gòu)考核品檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合程度 本次考核發(fā)放考核樣品34份，每份含10個(gè)樣品(3個(gè)陰性樣品，2個(gè)弱陽(yáng)性樣品，5個(gè)陽(yáng)性樣品)，規(guī)定時(shí)間內(nèi)回收結(jié)果30份。在完成考核的30家檢測(cè)機(jī)構(gòu)中，有22家使用試劑A，4家使用試劑B，試劑C、D、E和F各有1家實(shí)驗(yàn)室選用。結(jié)果共涉及6個(gè)廠家試劑，且使用各試劑廠家檢測(cè)的結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果100%相符。這30家檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果總符合率為100%，其中陽(yáng)性樣品符合率、陰性樣品符合率、全省疾控機(jī)構(gòu)總符合率、全省醫(yī)療機(jī)構(gòu)總符合率、第三方機(jī)構(gòu)總符合率均為100%?？己私Y(jié)果見表1。

表1 各試劑檢測(cè)結(jié)果

2.26組試劑檢測(cè)結(jié)果 本次完成考核的實(shí)驗(yàn)室中，22家使用試劑A，4家使用試劑B，其余實(shí)驗(yàn)室均只涉及一個(gè)廠家試劑，所用考核品10批，且每家實(shí)驗(yàn)室均完成了這10批考核品的檢測(cè)，其檢出結(jié)果見表2。由表可知，除1組試劑檢測(cè)ORF 1ab、N和E基因外，其余5組均檢測(cè)ORF 1ab和N基因，且各組試劑對(duì)靶基因的檢出率均為100%。

表2 6組試劑檢測(cè)結(jié)果

注：檢測(cè)次數(shù)為使用該試劑的實(shí)驗(yàn)室數(shù)與考核品批數(shù)(10)的乘積。

表3 試劑A、B檢測(cè)結(jié)果平均Ct值均值及CV

注：-為無(wú)數(shù)據(jù)。

2.3不同試劑檢測(cè)結(jié)果平均循環(huán)閾值(Ct)值及Ct值變異系數(shù)(CV) 本次完成考核的實(shí)驗(yàn)室中，22家使用試劑A，4家使用試劑B，其余實(shí)驗(yàn)室均只涉及一個(gè)廠家試劑，故本次考核只對(duì)試劑A和試劑B進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試劑A和試劑B的檢測(cè)結(jié)果Ct值均值及Ct值CV見表3。結(jié)果顯示,試劑A、B檢測(cè)結(jié)果的Ct值均值相差不大，但試劑A檢測(cè)結(jié)果的CV值波動(dòng)較小，在9%～12%之間，而試劑B檢測(cè)結(jié)果的CV值波動(dòng)較大，在6%～18%之間，由此可見，試劑A的批間重復(fù)性較試劑B要好。在弱陽(yáng)性樣品202002和202006的檢測(cè)中，試劑B的重復(fù)性均較試劑A好。

3 討 論

近期在湖北省武漢市出現(xiàn)的COVID-19，有極強(qiáng)的傳染性，引起了全國(guó)乃至世界的廣泛關(guān)注[7-8]。確診COVID-19的金標(biāo)準(zhǔn)是SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。

核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性涉及患者疾病發(fā)展過(guò)程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運(yùn)輸、樣品檢測(cè)等多過(guò)程。本次考核，只針對(duì)樣品檢測(cè)，包括核酸提取、擴(kuò)增體系、人員操作、室內(nèi)質(zhì)控等因素，即檢驗(yàn)中的質(zhì)量管理。本次考核所涉及的34家SARS-CoV-2核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，是由省級(jí)衛(wèi)生健康委員會(huì)指定，有5家醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)了ISO15189認(rèn)可，1家疾控實(shí)驗(yàn)室通過(guò)了ISO17025認(rèn)可。這些醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，包括第三方實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐，在質(zhì)量管理方面均有豐富的經(jīng)驗(yàn)，一些沒有通過(guò)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室，基本也是參照相關(guān)質(zhì)量管理體系進(jìn)行質(zhì)量管理。同時(shí)，對(duì)于國(guó)家或者省級(jí)臨床檢驗(yàn)中心開展了室間質(zhì)評(píng)的項(xiàng)目，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室都參加了相關(guān)項(xiàng)目的室間質(zhì)評(píng)，保障了檢驗(yàn)質(zhì)量。

本次考核的考核品包括陰性、弱陽(yáng)性和陽(yáng)性樣品。陰性樣品為稀釋液，陽(yáng)性樣品采用裝甲R(shí)NA技術(shù)，將3個(gè)目標(biāo)RNA序列(含ORF 1ab、N和E基因)用噬菌體蛋白外殼加以包裹，其結(jié)構(gòu)類似于天然病毒，以還原真實(shí)的樣品，本文所用的陽(yáng)性或弱陽(yáng)性考核品具有蛋白外殼，因此可作為抑制質(zhì)控品，與臨床標(biāo)本相似，可直接作為待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，全程模擬病毒裂解、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程，這是采用裸露的質(zhì)粒DNA或RNA片段作為質(zhì)控品所無(wú)法比擬的。且采用裝甲R(shí)NA技術(shù)制備的考核品具有穩(wěn)定、不易被RNA酶降解、無(wú)生物安全問(wèn)題、無(wú)傳染危險(xiǎn)性、可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)。

21家醫(yī)療機(jī)構(gòu)中，其中20家為三甲醫(yī)院，1家為三級(jí)醫(yī)院。參與的30家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，均建立了完整的質(zhì)量管理體系，嚴(yán)格按照操作規(guī)程和室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。所以在這次的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)中，才能夠出現(xiàn)100%的符合率。

在回報(bào)的30家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中，用于考核樣品檢測(cè)的試劑一共來(lái)自6個(gè)廠家，并且主要集中在傳統(tǒng)的2家基因試劑廠家上，占87%左右，說(shuō)明我國(guó)傳統(tǒng)試劑生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量是過(guò)硬的。本次完成考核的實(shí)驗(yàn)室中，22家使用試劑A，4家使用試劑B，其余實(shí)驗(yàn)室均只涉及一個(gè)廠家試劑，每家實(shí)驗(yàn)室均完成了這10批考核品的檢測(cè)，所使用的6個(gè)廠家試劑中，除1家試劑的檢測(cè)位點(diǎn)為ORF 1ab、N和E基因外，其余5家檢測(cè)位點(diǎn)均為ORF 1ab和N基因，且各組試劑對(duì)各基因的檢出率均為100%。專家認(rèn)為，理論上SARS-CoV-2的mRNA轉(zhuǎn)錄模式與SARS類似，細(xì)胞中SARS-CoV-2的mRNA是病毒基因組RNA的數(shù)倍，且在轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)形成不同長(zhǎng)度的mRNA片段，這些mRNA片段均含有N基因，而只有少數(shù)mRNA片段含有ORF 1ab基因，因此臨床樣本中N基因的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ORF 1ab，而目前的試劑盒主要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的病毒mRNA，因此N基因的檢測(cè)陽(yáng)性率要高于ORF 1ab基因；再者，N基因保守程度不及ORF 1ab基因，故少數(shù)樣本可能與其他類型冠狀病毒的核酸序列存在交叉而導(dǎo)致N基因擴(kuò)增陽(yáng)性而ORF 1ab基因陰性[9]。本次考核中，各試劑對(duì)ORF 1ab基因和N基因的檢出率均為100%，這可能與陽(yáng)性樣品中這2個(gè)基因的水平相當(dāng)及其穩(wěn)定性較臨床標(biāo)本高有關(guān)。

本次考核發(fā)現(xiàn)，與試劑B相比，試劑A具有較好的批間重復(fù)性。而6種試劑的檢出率均為100%，說(shuō)明目前臨床關(guān)注的SARS-CoV-2核酸檢出率低的問(wèn)題，與試劑盒檢出率大小關(guān)系不大，但部分試劑的穩(wěn)定性較差，因而各廠家試劑盒檢測(cè)性能有待進(jìn)一步優(yōu)化。臨床檢驗(yàn)全面質(zhì)量管理，其中的分析前質(zhì)量管理極其重要，患者疾病發(fā)展過(guò)程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運(yùn)輸?shù)?，?duì)檢測(cè)陽(yáng)性率有著決定性作用。筆者認(rèn)為，對(duì)于社會(huì)關(guān)注的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性率低的問(wèn)題，主要是由患者疾病發(fā)展過(guò)程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運(yùn)輸?shù)葐?wèn)題引起。加強(qiáng)與臨床和疾控采樣人員的溝通和聯(lián)系，共同對(duì)分析前進(jìn)行質(zhì)量管理，以保障檢驗(yàn)質(zhì)量，其意義非常重要。

對(duì)于貴州省臨床檢驗(yàn)中心組織的這次現(xiàn)場(chǎng)考核，由于時(shí)間緊，任務(wù)重，還存在許多不足之處，比如未對(duì)考核樣品的一致性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于考核品的定值是采用本實(shí)驗(yàn)室儀器進(jìn)行的，其準(zhǔn)確性可能存在一定的誤差。各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)這次考核非常重視，有的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了2次及以上的檢測(cè)，未能體現(xiàn)其真實(shí)檢測(cè)水平，也是造成全部符合的原因之一。盡管在研究中采取了裝甲R(shí)NA技術(shù)制備考核樣品，但是假病毒中只包含了ORF 1ab、N和E 3個(gè)目標(biāo)RNA序列，與真實(shí)病毒有著很大的差別，相對(duì)于真實(shí)病毒的核酸提取要容易得多。由于考核樣品是無(wú)感染性的，在檢測(cè)過(guò)程中沒有要求滅活，所以對(duì)于臨床標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中的滅活過(guò)程，是否會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，還有待驗(yàn)證。