流產(chǎn)患者抗心磷脂抗體表達與外周血膜聯(lián)蛋白A2表達的影響分析

王冬梅

陜西省榆林市榆陽區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科,陜西榆林 719300

由于各種因素的影響，當前流產(chǎn)患者在我國越來越多，特別是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)比較常見[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，特別是連續(xù)有2次自然流產(chǎn)經(jīng)歷后，第3次流產(chǎn)的概率在50%以上，可嚴重影響患者生活質(zhì)量及家庭和諧[2]。根據(jù)多次流產(chǎn)病因和發(fā)病具體機制，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可分為非免疫類復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和免疫類復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，其中妊娠≤12 周的流產(chǎn)多是由于遺傳因素、生殖方面免疫系統(tǒng)功能異常、內(nèi)分泌系統(tǒng)異常、血栓前狀態(tài)等原因引起[3]。妊娠>12 周的流產(chǎn)多由于血栓前狀態(tài)、子宮解剖異常、自身免疫功能異常等因素引起。免疫學(xué)上把妊娠定義為半同種移植，特別是母體的免疫系統(tǒng)遭受破壞時，胎兒將會受到母體免疫系統(tǒng)的攻擊，從而導(dǎo)致流產(chǎn)[4]?？剐牧字贵w(ACA)為抗磷脂抗體的一種，是以血小板和內(nèi)皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂作為靶抗原的自身抗體，其高表達能誘發(fā)流產(chǎn)[5]。膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)是一組在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為同源相似性的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，其高表達可誘發(fā)機體出現(xiàn)血栓形成、病理性妊娠、血小板減少等[6]。本文具體探討與分析了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者ACA表達與外周血ANXA2表達的影響與相關(guān)性，希望為闡明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機制提供參考?，F(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究得到了所有入選者的知情同意與本院倫理委員會的批準。選擇2017年2月至2019年6月在本院婦產(chǎn)科就診的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者120例作為流產(chǎn)組，同時選取同期本院120 例正常分娩的產(chǎn)婦作為對照組。納入標準：流產(chǎn)組符合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷標準[4]；流產(chǎn)組流產(chǎn)次數(shù)2次者74例，≥3次者46例，平均流產(chǎn)次數(shù)為(2.78±0.24)次；對照組沒有不孕不育史以及反復(fù)流產(chǎn)病史，且已正常分娩；單胎妊娠；年齡24～43歲；無內(nèi)分泌系統(tǒng)異常、生殖器官解剖異常；臨床資料完整。排除標準：因夫妻雙方染色體異常而發(fā)生過2次或2次以上的自然流產(chǎn)；臨床資料缺乏者；泌尿、生殖道感染者；主要臟器的急慢性疾病以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者；患有各種惡性疾病。兩組入選者的年齡、孕周、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2標本采集方法 所有入選者清晨空腹于肘靜脈抽取3～5 mL外周血，室溫靜置30 min后，2 500 r/min離心6 min，取上層血清分裝，-20 ℃低溫冰箱貯存。

1.3儀器與試劑 RNA提取試劑盒 mirvana PARIS、定量PCR檢測試劑盒 Tag Man MIRNA Reverse2 Transcription Kit 和 Taqman Real-time PCR assays 均購自德國Qiagen公司。ThermoNanoDrop 2000 Lite 分光光度計、旋渦振蕩器、高低速離心機等購自美國Bio-rad公司。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自南京森貝伽生物公司。

1.4檢測指標 采用酶聯(lián)免疫法檢測外周血ACA表達情況，陽性：樣品吸光度(A)值S/C.O.≥1(S/N≥2.1)；陰性：樣品A值S/C.O.<1(S/N<2.1)[7]。

采用定量PCR檢測外周血ANXA2相對表達水平，提出血清的總RNA，嚴格按照說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過NCBI網(wǎng)站進入Genbank 數(shù)據(jù)庫，查找ANXA2 mRNA全基因序列，設(shè)計引物，正向引物為5′-GTGCTGGGACACCACAACAATCACC-3′，反向引物為 5′-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-3′。實驗結(jié)果采用相對定量法(ΔΔCt)進行分析計算，以2-ΔΔCt計算相對表達量。

表1 兩組一般資料比較

2 結(jié) 果

2.1外周血ACA陽性率和ANXA2相對表達水平對比 流產(chǎn)組的外周血ACA陽性率和ANXA2相對表達水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組外周血ACA陽性率和ANXA2相對表達水平對比(n)

2.2不同流產(chǎn)次數(shù)患者ACA陽性率和ANXA2相對表達水平對比 連續(xù)流產(chǎn)≥3次的患者血清ACA陽性率和ANXA2相對表達水平顯著高于連續(xù)流產(chǎn)2次患者(P<0.05)，見表3。

表3 不同流產(chǎn)次數(shù)患者ACA陽性率和ANXA2相對表達水平對比

2.3Logistic回歸分析危險因素 在240例入選者中，二分類Logistic回歸分析顯示外周血ACA陽性率與ANXA2相對表達水平為導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表4。

2.4Spearman相關(guān)分析相關(guān)性 在流產(chǎn)組中，Spearman相關(guān)分析顯示外周血ACA陽性率與ANXA2相對表達水平呈正相關(guān)(r=0.673，P<0.001)；且兩者都與流產(chǎn)次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.544,P=0.008；r=0.611，P=0.002)。

3 討 論

隨著工作環(huán)境及生活方式的改變、全面二孩的開放，高齡孕產(chǎn)婦逐漸增多，當前我國女性臨床上發(fā)生自然流產(chǎn)的概率為15%左右，其中的80%以上為妊娠≤12 周發(fā)生流產(chǎn)，而復(fù)發(fā)性流產(chǎn)占比在5%左右[8]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的多次發(fā)生風(fēng)險隨著妊娠失敗次數(shù)的增多而增大，在臨床要引起足夠的重視并且具體分析相關(guān)病因[9]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在臨床上可分為染色體異常型、生殖道解剖異常型、內(nèi)分泌異常型、生殖道感染型、同種免疫型和自身免疫型[10]。隨著生殖免疫學(xué)等學(xué)科的興起與發(fā)展，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與免疫功能異常的關(guān)系逐漸得到重視。已有研究認為流產(chǎn)是母胎之間的免疫平衡遭到破壞，發(fā)生免疫排斥的結(jié)果[11]。

本研究顯示流產(chǎn)組的外周血ACA陽性率為65.0%，顯著高于對照組的9.2%(P<0.05)，且連續(xù)流產(chǎn)≥3次的患者血清ACA陽性率顯著高于連續(xù)流產(chǎn)2次患者(P<0.05)，說明ACA與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)存在密切的關(guān)系。ACA是一種以血小板和內(nèi)皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂作為靶抗原的自身抗體，也是可以檢測的一組自身免疫性抗體。正常情況下心磷脂位于細胞膜脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)層，不能被身體免疫系統(tǒng)識別。由于內(nèi)、外在因素的影響，心磷脂抗原會刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身免疫性抗體，這種自身免疫性抗體可以直接損害血管內(nèi)皮細胞，從而出現(xiàn)血栓、早產(chǎn)、死胎等。有研究顯示引起抗磷脂綜合征的機體可表現(xiàn)為反復(fù)動靜脈血栓形成、血小板減少、習(xí)慣性流產(chǎn)[12]。ACA的高表達可激活血小板的活性，促使血小板黏附、聚集，減少前列腺素的合成，并釋放出血栓素A2，促使胎盤血管收縮和血栓形成，最終形成血栓，致使胎兒氧供不足而死亡[13]。

本研究顯示流產(chǎn)組的外周血ANXA2相對表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，且連續(xù)流產(chǎn)≥3次的患者血清ANXA2相對表達水平顯著高于連續(xù)流產(chǎn)2次患者(P<0.05)。膜聯(lián)蛋白是一組在結(jié)構(gòu)上具有同源相似性的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可參與物質(zhì)運輸、細胞骨架形成、離子通道激活等多種生物學(xué)過程。ANXA2主要分布于單核細胞和內(nèi)皮細胞表面，且在胎盤細胞膜上也有分布，而這些細胞是抗磷脂抗體結(jié)合的靶抗原，因此，推測ANXA2與血栓形成、病理性妊娠、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。另一方面，ANXA2可介導(dǎo)β2糖蛋白1(β2GP1)與抗β2GP1結(jié)合為復(fù)合物，誘導(dǎo)凝血因子Ⅲ的表達，而凝血因子Ⅲ是外源性凝血活化途徑的始動因子，在血栓的形成中具有很大的作用，其高表達不僅可誘發(fā)流產(chǎn)，還可導(dǎo)致早產(chǎn)和死胎的發(fā)生，且大多發(fā)生在妊娠前2個月[14]。特別是ANXA2高表達可誘導(dǎo)血液單核細胞分泌炎性介質(zhì)和促凝介質(zhì)，活化單核細胞衍生的巨噬細胞，增加吞噬作用，誘導(dǎo)血栓形成和病理性妊娠[15]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)致病機制的研究比較深入，分析認為其與感染、免疫、遺傳、輻射、解剖、內(nèi)分泌、環(huán)境污染等有關(guān)，免疫因素是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的重要原因，占比在30%以上[16]。本研究中Spearman相關(guān)分析顯示流產(chǎn)組的外周血ACA陽性率與ANXA2相對表達水平呈正相關(guān)(r=0.673，P<0.001)；且兩者都與流產(chǎn)次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.544,P=0.008；r=0.611，P=0.002)。二分類Logistic回歸分析顯示外周血ACA陽性率與ANXA2相對表達水平為導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的危險因素(P<0.05)。也表明異常的自身免疫與妊娠顯著相關(guān)，推測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能存在一定程度的潛在因素，導(dǎo)致出現(xiàn)自身免疫失調(diào)，從而使得外周血ACA陽性率與ANXA2相對表達水平異常。本研究也存在一定不足，檢測的樣本數(shù)量較少，且分析指標不多，將在后續(xù)研究中進行深入分析。

總之，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者多表現(xiàn)外周血ACA陽性與ANXA2相對表達水平增加，兩者可互相影響，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與發(fā)展。