血漿miRNA-21和miRNA-126與心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)性研究

李童 米小龍 李學(xué)文

急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）在我國發(fā)病率和死亡率均較高。目前經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention， PCI）已成為STEMI首選的治療方法，早期及時有效地開通梗死相關(guān)血管能明顯減少梗死心肌的面積，降低病死率，另一方面不可避免帶來心肌再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）使患者預(yù)后不良［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，約30%患者行PCI時血管已自發(fā)再通，這部分患者由于早期閉塞血管自行再通能夠較早地恢復(fù)血流，PCI術(shù)后臨床預(yù)后優(yōu)于血管仍閉塞患者，其原因可能與再灌注損傷程度相關(guān)［2］。如何減輕PCI術(shù)后再灌注損傷意義重大，以往減輕再灌注損傷的藥物和機械手段在臨床轉(zhuǎn)化的過程中大部分都失敗了，因此從基因分子水平研究再灌注損傷，可能為臨床上減輕再灌注損傷提供新方向。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)一類小分子非編碼RNA，可在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在。miRNA在心肌細(xì)胞中表達豐富，與心肌梗死、心律失常、心肌肥厚和再灌注損傷等疾病密切相關(guān)，其中miRNA-1、miRNA-21、miRNA-126、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-499等已被證明是心肌特異性較好的miRNA［3-5］。另有研究表明，miRNA-21能抑制再灌注損傷時的細(xì)胞凋亡，miRNA-126具有維持血管結(jié)構(gòu)、抑制血管炎性反應(yīng)的作用，且與再灌注損傷嚴(yán)重程度相關(guān)［6-7］。本研究旨在通過觀察STEMI患者PCI術(shù)前后miRNA-21、miRNA-126表達水平的差異，探討二者與MIRI的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性研究，選取2017年6月至2018年12月在山西白求恩醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的急性STEMI患者100例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1） 首次發(fā)病伴持續(xù)性胸痛癥狀，缺血性胸痛發(fā)作＜12 h；（2）心電圖顯示相鄰2個及以上導(dǎo)聯(lián)ST段抬高＞0.1 mV或新出現(xiàn)左束支傳導(dǎo)阻滯伴心肌壞死標(biāo)志物升高［8］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往接受過溶栓、PCI或冠狀動脈旁路移植術(shù)治療；（2）合并急慢性感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、周圍血管疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、全身免疫性疾病、慢性肺疾病、腦梗死、腦出血、腎動脈狹窄等其他動脈狹窄相關(guān)疾病。所有入選患者冠狀動脈造影時根據(jù)心肌梗死溶栓治療試驗（thrombolysis in myocardial infarction，TIMI）血流分為血管自發(fā)再通（spontaneous reperfusion，SR）組（即SR組，39例）和非SR組（61例）。SR組為TIMI血流分級Ⅱ～Ⅲ級，非SR組為TIMI血流分級 0～Ⅰ級。TIMI血流分級：0級，無血流灌注，閉塞血管遠(yuǎn)端無血流；Ⅰ級，對比劑能部分通過，冠狀動脈遠(yuǎn)端不能完全顯影；Ⅱ級，經(jīng)過3個以上心動周期病變遠(yuǎn)端血管才能完全充盈，顯影較慢；Ⅲ級，冠狀動脈狹窄遠(yuǎn)端對比劑完全通過且迅速充盈［9］。所有患者均無精神異?；蛘Z言交流障礙，且本人及家屬知情同意。本研究方案經(jīng)山西白求恩醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集

收集患者一般資料，包括性別、年齡、血壓、糖尿病史、吸煙史，記錄患者入院時血糖、腎功能等一般化驗指標(biāo)；于PCI術(shù)前、術(shù)后12 h抽取靜脈血測定心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）及高敏C反應(yīng)蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）等指標(biāo)。

1.3 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定miRNA-21、miRNA-126表達水平

所有患者于行急診PCI術(shù)前及術(shù)后12 h，抽取2 ml靜脈血于乙二胺四乙酸管中，靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3000 r/min離心15 min，留取上層血漿于無RNA酶的1.5 ml微量離心管（EP管）中，置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。采用天津生化科技公司的總RNA提取試劑盒提取血漿總RNA。采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。采用TaKaRa公司的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒檢測miRNA-21與miRNA-126。采用美國ABI公司的7500 PCR儀，每個樣本均設(shè)置三個重復(fù)孔，運用2-△△CT法測定兩種miRNA的相對表達水平［6］。引物購自美國Invitrogen公司，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，同組數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料采用頻數(shù)（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。采用 Pearson檢驗對miRNA-21、miRNA-126與cTnI、CKMB、hs-CRP的表達進行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床資料情況比較

兩組患者性別、年齡、吸煙史、糖尿病史、收縮壓、舒張壓、血脂水平、血糖、肌酐、發(fā)病至PCI時間、梗死相關(guān)血管等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。

2.2 兩組患者手術(shù)前后cTnI、CK-MB及hs-CRP比較

兩組患者PCI術(shù)前cTnI、CK-MB及hs-CRP表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；非SR組PCI術(shù)后cTnI、CK-MB、hs-CRP表達水平較SR組更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05，表3）。

2.3 miRNA-21、miRNA-126相對表達水平的比較

兩組患者PCI術(shù)前miRNA-21和miRNA-126的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；非SR組患者PCI術(shù)后miRNA-21、miRNA-126表達水平較SR組更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，表4，圖1～2）。

2.4 miRNA-21、miRNA-126與cTnI、CK-MB及hs-CRP的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，miRNA-21表達水平與cTnI（r=0.557，P＜0.001）、CK-MB（r=0.625，P＜0.001）、hs-CRP（r=0.606，P=0.001）呈正相關(guān)，miRNA-126 表達水平與cTnI（r=0.543，P=0.004）、CK-MB（r=0.669，P＜0.001）、hs-CRP（r=0.558，P=0.002）呈正相關(guān)（圖3）。

3 討論

早在1960年，Jennings等［10］就觀察到缺血再灌注時心肌組織出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、細(xì)胞外皮破裂、肌原纖維攣縮等改變，并將此稱為MIRI。目前認(rèn)為再灌注損傷可能存在兩個階段：（1）再灌注后早期階段，由氧化應(yīng)激、炎性因子、鈣超載等造成心肌細(xì)胞急性損傷，如凋亡或壞死；（2）再灌注晚期階段，由于纖維組織再生引起心室重塑造成不可逆心功能損傷。通過對再灌注損傷機制的更深入認(rèn)識，人們發(fā)現(xiàn)腦、心臟、腎等臟器缺血再灌注后不同時間段，多種miRNA表達發(fā)生顯著變化。

miRNA-21是miRNA家族中的一個亞型，定位于17號染色體，在多種心臟疾病中過表達［11-12］。Dong等［13］建立大鼠心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)在心肌梗死發(fā)生后6 h左右相比于梗死區(qū)周圍組織，miRNA-21在心肌梗死區(qū)組織中表達明顯下降，而通過缺血預(yù)處理可以減輕這種差別，表明miRNA-21表達的增加并不是缺血導(dǎo)致的。該研究在心肌梗死發(fā)生24 h后用腺病毒轉(zhuǎn)染過表達的miRNA-21能觀察到大鼠心肌梗死面積明顯減少，說明miRNA-21能對缺血誘發(fā)的細(xì)胞損傷發(fā)揮保護作用；運用蛋白質(zhì)印跡法及熒光素酶進一步分析，揭示其保護機制主要通過負(fù)性調(diào)控其靶基因程序性細(xì)胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）和下游靶點活化蛋白-l。缺血心肌再灌注早期時活性氧自由基爆發(fā)式增長可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Cheng等［6］發(fā)現(xiàn)活性氧自由基處理后心肌細(xì)胞miRNA-21表達增強，同時PDCD4表達降低，miRNA-21通過特異性抑制PDCD4表達，降低活性氧自由基誘發(fā)的細(xì)胞死亡，提高細(xì)胞存活率，印證了Dong等［13］的研究。此外，miRNA-21還能通過抑制彈力蛋白同工異構(gòu)體的表達激活蛋白激酶B信號途徑從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，誘導(dǎo)miRNA-21表達能減輕心肌缺血再灌注損傷［14］。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

表3 兩組患者PCI 術(shù)前后cTnI、CK-MB 及hs-CRP情況比較（±s）

表3 兩組患者PCI 術(shù)前后cTnI、CK-MB 及hs-CRP情況比較（±s）

注：PCI，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療；SR，自發(fā)再通；cTnI，心肌肌鈣蛋白I；CK-MB，肌酸激酶同工酶；hs-CRP，高敏C 反應(yīng)蛋白；a，與非SR 組術(shù)后比較，P ＜0.05

SR 組（39 例）術(shù)前 術(shù)后 術(shù)前 術(shù)后cTnI（ng/ml） 6.24± 4.41 58.43±39.11 6.20± 4.49 39.66±21.19a CK-MB（ng/ml） 76.71±38.08 138.94±69.77 68.95±29.93 92.78±37.01a hs-CRP（mg/L） 13.01± 6.90 21.33±10.74 11.75± 6.32 16.50± 7.64a項目非SR 組（61 例）

表4 兩組患者PCI 術(shù)前后miRNA-21、miRNA-126相對表達水平（±s）

表4 兩組患者PCI 術(shù)前后miRNA-21、miRNA-126相對表達水平（±s）

注：PCI，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療；SR，自發(fā)再通；a，與非SR 組比較，P ＜0.001

項目 非SR 組（61 例） SR 組（39 例）術(shù)前 術(shù)后 術(shù)前 術(shù)后miRNA-21 1.46±0.257 1.98±0.46 1.35±0.25 1.68±0.22a miRNA-126 1.74±0.13 2.54±0.56 1.63±0.22 1.75±0.33a

圖 1 兩組PCI術(shù)前、后miRNA-21的相對表達水平

圖 2 兩組PCI術(shù)前、后miRNA-126的相對表達水平

圖 3 miRNA-21、miRNA-126與cTnI、CK-MB及hs-CRP相關(guān)性散點圖 A.miRNA-21與cTnI相關(guān)性散點圖；B.miRNA-126與cTnI相關(guān)性散點圖；C.miRNA-21與CK-MB相關(guān)性散點圖；D.miRNA-126與CK-MB相關(guān)性散點圖；E.miRNA-21與hs-CRP相關(guān)性散點圖；F.miRNA-126與hs-CRP相關(guān)性散點圖

miRNA-126在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達，在維持血管完整性、新生血管形成和損傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用［15］。既往在糖尿病大鼠模型上發(fā)現(xiàn)miRNA-126通過SPRED1基因表達，改善血管內(nèi)皮的修復(fù)功能，抵御高血糖對血管內(nèi)皮破壞，該研究顯示血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）-1是miRNA-126的靶基因。VCAM-1作為細(xì)胞黏附分子超家族的成員之一，可以募集炎性細(xì)胞，促進炎性反應(yīng)的發(fā)展。而miRNA-126 能夠通過抑制VCAM-1表達，減弱白細(xì)胞的黏附，減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，從而減輕血管損傷［16］。Zernecke等［17］研究證實，miRNA-126可通過激活基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的趨化因子受體4抑制細(xì)胞凋亡。以上研究對象均為動物、細(xì)胞模型，臨床上是否與實驗室具有相似的結(jié)果尚缺乏研究證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)所有患者PCI術(shù)后miRNA-21、miRNA-126表達水平較術(shù)前上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致，說明二者參與PCI術(shù)后再灌注損傷。

氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)一直被認(rèn)為是再灌注損傷的關(guān)鍵機制，通過激活體內(nèi)多種細(xì)胞信號通路，使大量的超氧離子、炎性因子集聚在組織間擴大損傷效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。本研究選取能較好反應(yīng)再灌注時心肌損傷和炎性反應(yīng)相關(guān)的指標(biāo)，心肌損傷或壞死時細(xì)胞膜通透性增高，心肌酶釋放入血液中， cTnI、CK-MB作為心肌特異性標(biāo)志物，是目前公認(rèn)的急性心肌梗死診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。炎癥反應(yīng)是再灌注損傷機制的重要一環(huán)，hs-CRP是一種非特異性急性時相蛋白，可精確反映體內(nèi)炎癥程度，其持續(xù)升高常常提示體內(nèi)損傷和炎癥反應(yīng)程度較重。本研究發(fā)現(xiàn)，PCI術(shù)后cTnI、CK-MB、hs-CRP較術(shù)前明顯上升，非SR組患者術(shù)后血中cTnI、CK-MB、hs-CRP濃度高于SR組，表明非SR組再灌注損傷程度較SR組嚴(yán)重；除此之外本研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miRNA-126也有類似趨勢，造成這一結(jié)果的原因可能是兩組發(fā)生再灌注損傷程度不同，非SR組患者梗死血管支配區(qū)域血供差，心肌缺血時間較長，再灌注造成的心肌損傷更重引起miRNA-21、miRNA-126表達水平明顯上升。為了進一步驗證二者與心肌損傷關(guān)系，本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miRNA-126與cTnI、CK-MB、hs-CRP呈正相關(guān)，說明二者水平越高，再灌注后心肌損傷程度越重。

綜上所述，本研究表明心肌缺血再灌注損傷同樣會使人體內(nèi)miRNA-21，miRNA-126表達水平上調(diào)，二者與心肌損傷程度呈正相關(guān)。本研究為單中心研究，存在樣本量不足、樣品收集及儲存方式等原因?qū)ρ芯拷Y(jié)果造成偏倚，另外本研究僅觀察到再灌注前后miRNA-21、miRNA-126表達的變化，由于miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，一種miRNA能作用于多個靶基因，二者參與早期再灌注損傷具體調(diào)控機制未來需要更多相關(guān)研究來證實。