CTRP9在糖尿病視網(wǎng)膜病變病程進(jìn)展中的表達(dá)及其意義*

王芃萱，劉勤，白惠玲，張書，蘇萌，朱曉燕

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR），是糖尿病常見并發(fā)癥之一，主要因高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管壁滲漏等視網(wǎng)膜損傷引起患者視力下降［1］。有研究顯示，隨著世界糖尿病患者人數(shù)的增加，DR患者的數(shù)量估計到2030將增加到1.91億［2］，巨大的患病人數(shù)給我國人民身體健康及視力預(yù)后帶來了極大的危害［3］。由脂肪組織分泌的脂肪因子中如瘦素、白介素-6、超敏C反應(yīng)蛋白等許多成員都能夠通過調(diào)節(jié)胰島素抵抗、氧化應(yīng)激等方式參與DR的發(fā)病過程［4］。在科技與醫(yī)療的發(fā)展下，C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9（CTRP9）于2009年被Wong等［5］發(fā)現(xiàn)，并與脂肪因子家族中的脂聯(lián)素（adiponectin，APN）有著高度同源性，在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）、脂質(zhì)代謝異常、冠心病等疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用［6-8］，是近幾年所發(fā)現(xiàn)的最具價值的脂肪細(xì)胞因子，但CTRP9是否也參與DR的發(fā)病過程，目前相關(guān)研究還比較少。因此本研究通過構(gòu)建DR動物模型，探討CTRP9在DR病程變化中的表達(dá)情況及其意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供的健康、無眼部疾患、1個月齡SPF級SD大鼠45只。單籠飼養(yǎng)于溫度18℃～20℃，濕度50%～60%，通風(fēng)干燥的SPF級動物實驗室，自由飲食，每隔2 d清洗消毒籠具、飲水器具。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購于美國Sigma公司；Trizol試劑盒購于日本Takara公司；自美國Sigma公司及abcam公司分別購得CTRP9、內(nèi)參GAPDH兔抗鼠抗體。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物造模與給藥方法

以相同條件適應(yīng)性飼養(yǎng)全部大鼠1周，按照隨機數(shù)字表法從中選取15只作為正常對照組。剩余所有大鼠先建立糖尿病大鼠模型：禁食12 h后，于大鼠腹腔快速注射濃度為50 mg/kg的STZ，注射時間為3 d，并采用高糖高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。3 d后抽取大鼠尾靜脈血測血糖，結(jié)果顯示血糖大于16.7 mmol/L，尿糖達(dá)到3到4個“+”且持續(xù)觀察一周，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)生長緩慢等糖尿病表現(xiàn)即糖尿病模型造模成功。實驗后續(xù)每7 d監(jiān)測血糖一次，保留其中血糖大于16.7 mmol/L且穩(wěn)定大鼠，實驗過程中3只大鼠血糖低于標(biāo)準(zhǔn)已排除，用以保障3月后所有糖尿病模型組大鼠DR造模成功。將DR成模大鼠隨機分為DR 5周組（5W組）及DR 10周組（10W組），每組均為15只，分別繼續(xù)飼養(yǎng)5周及10周。正常對照組大鼠在DR組造模同時給予腹腔注射同等劑量的檸檬酸緩沖液，3 d后測空腹血糖，行普通飼料喂養(yǎng)。此過程中剔除死亡鼠，其中，5W組死亡1只、10W組死亡3只大鼠。

1.3.2 HE染色觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)改變

各組實驗大鼠隨機選取2只腹腔注射10%水合氯醛麻醉過量處死，立即摘取雙眼眼球，小心去掉眼前節(jié)組織，分離視網(wǎng)膜，使用不同濃度酒精作為脫水劑逐次脫水，石蠟包埋。固定蠟塊后切片，片厚4μm，置于載玻片上烤干，經(jīng)蘇木精及伊紅分別染色后脫水、脫色及封閉后在顯微鏡下對各組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3.3 RT-PCR法檢測大鼠視網(wǎng)膜CTRP9 mRNA表達(dá)水平

自每組中隨機選擇三只大鼠，采用10%水合氯醛進(jìn)行大鼠麻醉過量處死，迅速取下雙眼眼球，對視網(wǎng)膜組織進(jìn)行分離，并存放入液氮中進(jìn)行打碎。依據(jù)Trizol說明書，通過在冰上操作提取視網(wǎng)膜總RNA，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)總RNA未被DNA及其他雜質(zhì)污染，取3μL總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物委托Takara公司合成。引物序列：CTRP9 上游：5，-TTCACGGGCTTCCTTCTGTT-3，，下游：5，-AGTCACATCCTACCCTCACCAAG-3，。β-actin上游：5，-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3，，下游：5，-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3，。PCR循環(huán)程序：預(yù)變性95℃1 min，變性95℃30 s，退火59℃30 s，延伸72℃45 s，共28個循環(huán)；72℃7 min結(jié)束反應(yīng)。

1.3.4 Western blot檢測CTRP9蛋白表達(dá)水平

剩余大鼠同上方法處死、摘取眼球、分離得視網(wǎng)膜組織，使用TBST和蒸餾水反復(fù)沖洗，根據(jù)裂解液配比按每30 mg加入450μL RIPA裂解液充分裂解視網(wǎng)膜組織，將視網(wǎng)膜置于冰上小心剪碎、充分勻漿EP管中的組織，勻漿液離心2次，每次各10 min，溫度及轉(zhuǎn)速為4℃、12 000 r/min。取含有蛋白質(zhì)的上清液，檢測蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量保證等質(zhì)量上樣。配制10%SDSPAGE膠上樣30μg，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗于室溫微搖1 h后4℃冰箱靜置過夜，用TBST置于搖床洗滌3次（10 min），與二抗室溫微搖2 h，同上方法洗膜3次后于將膜上加入發(fā)光液顯影，目的蛋白的相對表達(dá)量用目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值之比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

該項研究選擇SPSS 25.0軟件處理，計量資料以（G±S）表示，并實施t檢驗與單因素方差分析，如經(jīng)計算P＜0.05說明有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色（×400）

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色表現(xiàn)

對照組大鼠視網(wǎng)膜組織未發(fā)現(xiàn)顯著的病理性變化（圖1A）；DR 5W組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)個別細(xì)胞水腫（圖1B黑色箭頭處），內(nèi)核層部分區(qū)域細(xì)胞排列疏松；DR 10W組視網(wǎng)膜組織明顯水腫，神經(jīng)上皮層可見增生的毛細(xì)血管，內(nèi)、外核層排列紊亂，毛細(xì)血管明顯擴張，腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，結(jié)構(gòu)組織疏松腫脹并出現(xiàn)層間偶伴融和（圖1C黑色箭頭處）。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中CTRP9 mRNA表達(dá)水平

DR組大鼠視網(wǎng)膜CTRP9 mRNA表達(dá)對比正常組水平降低（P＜0.05）；與5W組比較，10W組大鼠視網(wǎng)膜CTRP9 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。如圖2所示及表1所列。

圖2 RT-PCR法檢測各組CTRP9 mRNA表達(dá)水平柱狀圖

表1 各組視網(wǎng)膜組織中CTRP9 mRNA表達(dá)水平（xˉ±s）

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織CTRP9含量

Western blot檢測結(jié)果與正常組比較，5W大鼠CTRP9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與正常組比較，10W組大鼠CTRP9蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。如圖3-4所示。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織CTRP9蛋白表達(dá)量對比

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織CTRP9蛋白表達(dá)對比

3 討論

DR是糖尿病晚期出現(xiàn)的一種并發(fā)癥，已經(jīng)成為導(dǎo)致人類失明的主要原因之一，其發(fā)病機制非常復(fù)雜，現(xiàn)階段還無法予以明確。DR早期病理改變主要為毛細(xì)血管周細(xì)胞丟失、基底膜增厚及微血管瘤產(chǎn)生［9］，隨著DR病程的延長，血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞、毛細(xì)血管閉塞伴隨新生血管及纖維組織生成增多，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的損傷程度越發(fā)嚴(yán)重［10］。本實驗視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果顯示大鼠視網(wǎng)膜組織的病變隨著DR大鼠飼養(yǎng)期延長而越發(fā)嚴(yán)重，其中10W組組織水腫最明顯、各層之間細(xì)胞排列紊亂，提示本實驗造模成功。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織作為胰島素的靶器官，其分泌的脂肪因子調(diào)控異常與肥胖、T2DM等代謝性疾病的發(fā)病有著密切的聯(lián)系［11］，APN是脂肪細(xì)胞因子中的重要組成部分，在T2DW與并發(fā)癥病情控制方面存在顯著意義［12］。新生血管的生成對DR患者視網(wǎng)膜組織通常造成較大的損傷，對視力也有較大影響，研究發(fā)現(xiàn)APN通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化氮合酶，使NO含量增高，從而減輕新生血管對視網(wǎng)膜組織的損傷［13-14］。臨床研究也顯示，在DR病程的各個分期，APN水平均明顯低于對照組［15］，當(dāng)患者血清APN水平降低時，其血管內(nèi)皮舒張功能受限，從而對DR患者的視網(wǎng)膜微血管造成損傷［16-17］。CTRP9與APN的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，研究發(fā)現(xiàn)CTRP9也可提高外周組織對葡萄糖的攝取，顯著降低血糖濃度［6］，且在T2DM患者的血液中CTRP9與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α ，TNF-α）的濃度呈負(fù)相關(guān)，通過二甲雙胍治療后血漿CTRP9濃度上升，說明CTRP9與T2DM的發(fā)病有相關(guān)性［7-8］。CTRP9作為近年來新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，與APN有著類似的生理作用，APN能夠通過多種方式減輕DR對視網(wǎng)膜組織的損傷，但近年來關(guān)于CTRP9對在DR發(fā)病中所起作用的研究還較少，因此探究CTRP9對DR的保護(hù)作用對DR的早期診斷、治療有著重要意義。

本研究中，RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示CTRP9的mRNA及蛋白表達(dá)在5W組及10W組較正常組均明顯減少（P＜0.05），且10W組蛋白表達(dá)量最少，提示正常視網(wǎng)膜組織中CTRP9含量高、DR視網(wǎng)膜組織中含量低且隨病情的加重而減少。既往關(guān)于CTRP9在T2DM發(fā)病中的研究顯示，將胰島素分別注入到不同小鼠體內(nèi)，經(jīng)一段時間后可了解，實驗組小鼠的肝臟內(nèi)胰島素激活的Akt通路受到抑制，其胰島素的濃度有所增加，實驗組與對照組的對比中，可了解到口服糖耐量試驗過程中小鼠體內(nèi)胰島素含量有所減少，由此表明CTRP9可通過減輕胰島素抵抗情況降低小鼠血糖濃度，從而對T2DM有著保護(hù)作用［6］。還有研究顯示，CTRP9可使T2DM小鼠促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)下降，如CTRP9能夠抑制超氧化物歧化酶的生成，從而延緩肥胖與T2DM的發(fā)生發(fā)展［18］，因此本實驗在大鼠糖尿病模型造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)5周及10周，模擬DR的發(fā)病過程，探究CTRP9在DR不同病程中的表達(dá)情況，實驗結(jié)果提示CTRP9與DR的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，且其表達(dá)水平隨著DR病程的進(jìn)展持續(xù)減少。過去對CTRP9與DR發(fā)病及氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究中顯示，同樣作為一種具有抗氧化功能的蛋白，硫氧還蛋白（thiore?doxin，Trx）能夠提升人視網(wǎng)膜色素上皮的抗氧化應(yīng)激能力，對視網(wǎng)膜有著保護(hù)作用，經(jīng)過外源性Trx腹腔注射治療后，治療組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)CTRP9含量與DR模型組CTRP9表達(dá)明顯增多，提示Trx促進(jìn)CTRP9的表達(dá)從而減輕了DR氧化應(yīng)激反應(yīng)對視網(wǎng)膜的損害作用［19］。還有研究顯示在db/db小鼠體內(nèi)靜脈注射表達(dá)CTRP9的腺病毒載體后，CTRP9可抑制db/db小鼠視網(wǎng)膜中的多種炎癥因子的表達(dá)。此外，CTRP9還能防止db/db小鼠血視網(wǎng)膜屏障的斷裂和緊密連接蛋白的下調(diào)，能顯著減輕DR早期血管滲漏的狀況，從而通過多種方式抑制DR的炎癥反應(yīng)［20］。臨床研究也顯示與正常對照組比較，DR患者血清CTRP9及其同家族的CTRP3水平均降低，表明兩者水平下降與糖尿病發(fā)生存在相關(guān)性［21］。本實驗關(guān)于CTRP9在DR大鼠中的表達(dá)降低的結(jié)果與既往研究相符，但由于本實驗樣本量較少且對于DR病程進(jìn)展的觀察時間較短，在更長的DR病程中CTRP9將如何變化以及在DR病程中CTRP9通過何種途徑參與DR的發(fā)病還需進(jìn)更加深入的研究。

綜上所述，CTRP9與DR的發(fā)病相關(guān)，且隨著DR病情的加重，CTRP9的含量隨之減少，提示DR患者體內(nèi)CTRP9減少，可能伴有DR病情進(jìn)展，補充或調(diào)節(jié)體內(nèi)CTRP9合成分泌，增加CTRP9的表達(dá)水平，有望成為防治DR的新干預(yù)措施。