結直腸癌中HIF-1α、CD147和MMP-9表達與臨床病理特征的關系*

朱長龍，王曉瓊，何常

(1.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴陽護理職業(yè)學院 基礎醫(yī)學部，貴州 貴陽 550081)

結直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在發(fā)達國家中的 發(fā)病率明顯高于發(fā)展中國家，這可能與發(fā)達國家較高的肥胖率及飲食習慣等因素有關[1]。結直腸癌的病因和發(fā)病機制目前尚不完全清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌的發(fā)生與許多腫瘤抑制基因失活、或原癌基因活化密切相關，提示結直腸癌發(fā)生過程中經(jīng)過了一系列較為復雜的分子事件。研究表明，缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導劑(CD147)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMP)均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和不良預后密切有關[2]，本研究應用免疫組織化學技術標記結直腸癌組織中HIF-1α、CD147和MMP-9蛋白表達，分析這些指標與各種臨床病理參數(shù)的關系，初步探討這些指標對評估結直腸癌生物學行為的潛在關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本 收集病理科2012年1-6月80例結直腸癌手術患者的臨床資料，隨機選取其中37例未經(jīng)新輔助化療的結直腸腺癌作為實驗組，記錄患者的性別、年齡，收集腫瘤的病理分級、大小、部位、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結轉移及TNM分期等臨床病理參數(shù)，同時選擇這37例患者結直腸癌切除組織旁的正常(癌旁)組織作為對照組。

1.1.2主要試劑 Anti-HIF-1α抗體(Santa Cruz，sc-13515,單克隆抗體)、Anti- CD147抗體(Santa Cruz，sc-21746,單克隆抗體)、Anti-MMP-9抗體(Santa Cruz，sc-21733,單克隆抗體)和免疫組化二抗EnvsionTM由上海基因有限公司提供。

1.1.3納入和排除標準 納入標準按照2003版WHO結直腸癌病理診斷和分級標準：(1)有完整的性別、年齡、病理分級、腫瘤部位、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結轉移及TMN分期資料，(2)入組患者經(jīng)過首次病理確診行腫瘤根治術治療、未進行術前新輔助化療[3]。排除標準：(1)雙盲法復診時病理診斷和病理分級不一致的樣本，(2)患者資料不完整的樣本，(3)術前進行新輔助化療，導致病理組織學形態(tài)發(fā)生改變者[4]。

1.2 方法

按照EnvsionTM步驟處理組織標本，切取的組織標本石蠟包埋切片厚3 μm，60 ℃烤箱烘烤90 min；浸入兩缸二甲苯中、每缸中脫蠟10 min，再逐級放入100%無水酒精、90%酒精、70%酒精、純水各浸泡 5 min，3%過氧化氫孵育10 min，PBS溶液沖洗3次、每次3 min；浸泡在0.01 mmoL/L的EDTA(pH9.0)抗原修復液中，高溫高壓修復3 min；修復后室溫下靜置冷卻30 min，PBS溶液反復沖洗3次(3min/次)，滴加山羊血清封閉20 min、滴加一抗，4oC冰箱中孵育過夜、孵育過夜的切片在室溫中復溫40 min；PBS沖洗3次(3min/次)，滴加二抗，37 ℃水浴箱孵育1 h、二抗孵育完成后PBS沖洗3次(3min/次)，DAB顯色5 min后鏡下觀察顯色情況、PBS沖洗3次3 min滴加蘇木素染色1 min，自來水沖洗 3 min、脫水、最后進入二甲苯透明5 min 3次；中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，由2名病理醫(yī)師雙盲法判定結果。

1.3 觀察指標

實驗組和對照組各取37張切片，每張切片隨機選取5個200倍視野，實驗組觀察計數(shù)結直腸癌中500個結直腸癌細胞，對照組觀察計數(shù)500個結直腸正常腺體上皮細胞。觀察兩組切片中HIF-1α、CD147和MMP-9蛋白染色強度評分和陽性細胞百分率，染色強度分數(shù)定義為0、1、2、3，不著色為0、淺黃色為1、棕黃色為2、黃褐色為3；計數(shù)500個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性百分率，陽性百分率評分：1%～25%記為1分、26%～50%記為2分、51%～75%記為3分、>75%記為4分。強度和百分比的乘積作為免疫組化評分(IRS)，IRS評分<4分判讀為陰性表達、≥4分者為陽性表達[5]。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗，2組間比較以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，采用Pearson法對HIF-1α、CD147和MMP-9蛋白陽性表達進行相關性分析。

2 結果

2.1 HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達

結果顯示，實驗組HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 兩組組織標本中HIF-1α、CD147和MMP-9表達(Envison，×200)Fig.1 The expression of HIF-1α, CD147and MMP-9 in two groups of tissue samples(Envison，×200)

表1 兩組組織標本中HIF-1α、CD147和MMP-9表達[n(%)]Tab.1 The expression of HIF-1α, CD147and MMP-9 in two groups of tissue samples[n(%)]

2.2 HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關系

腫瘤組織中HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理分級、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管受累、淋巴結轉移及TNM分期無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HIF-1α及CD147蛋白表達與腫瘤大小有關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達與淋巴結轉移有關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HIF-1α、CD147及MMP-9表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]Tab.2 Correlation between the expression of HIF-1α, CD147and MMP-9 and clinicopathological features of colorectal cancer patients[n(%)]

2.3 結直腸癌中 HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達的相關性

Pearson相關性分析結果顯示，結直腸癌腫瘤組織中HIF-1α、MMP-9及CD147蛋白表達間互相呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 結直腸癌患者HIF-1α、CD147和MMP-9表達的相關性Tab.3 The correlation between expression of HIF-1α, CD147 and MMP-9 in colorectal cancer patients

注：(1)P<0.05。

3 討論

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在中國乃至全球均有非常高的發(fā)病率和致死率。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)結直腸癌發(fā)病與低纖維、高脂肪飲食，肥胖率增加等風險因素有密切關系[6]。隨著對結直腸癌研究不斷深入，認為結直腸癌可能是在各種致腫瘤因素共同作用下，逐漸經(jīng)過一系列如原癌基因活化，腫瘤抑制基因突變，腫瘤抑制基因缺失，啟動子甲基化和或乙?；馗淖兊确肿邮录橛胁±斫M織形態(tài)學改變及惡性腫瘤生物學行為后，最終導致結直腸癌的發(fā)生。

HIF在人類編碼6種蛋白，其中HIF-1α是目前關注的熱點。越來越多的證據(jù)表明，隨著腫瘤生長速度增快，導致供血不足，形成局部缺氧，是腫瘤環(huán)境中最常見的一種情況[7]。在缺氧環(huán)境中，HIF-1α易活化，HIF-1α活化后促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF、hgf和met原癌基因的表達，并參與糖代謝，紅細胞生成，血管形成。同時參與細胞存活、凋亡以及對腫瘤藥物抗藥性形成等重要生物學功能中，從而維持組織、細胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以適應缺氧[8]。在人類多種實體腫瘤中都可檢測到HIF-1α高表達。應用免疫組織化學技術檢測134例鋸齒狀息肉、104例非鋸齒狀腺瘤、81例囊性腺瘤和74例鋸齒狀結直腸癌檢測HIF-1α和VEGF，發(fā)現(xiàn)鋸齒狀息肉和鋸齒狀結直腸癌普遍存在HIF-1α表達增高，提示HIF-1α對在腫瘤發(fā)生和進展起著重要作用[9]。本組研究結果顯示，37例結直腸癌組織中，HIF-1α蛋白陽性率為70.3%(26/37),正常對照組織中為13.5%(5/37)，HIF-1α蛋白在結直腸癌腫瘤組織中明顯高于正常組織(P<0.05)，同時在實體腫瘤中腫瘤直徑大者(P<0.05)和有淋巴結轉移者(P<0.05)明顯出現(xiàn)HIF-1α蛋白高表達。綜合以往的研究結果，本研究認為在正常結直腸組織和結直腸癌早期以及腫瘤體積較小時候，由于有足夠的血液供應，細胞微環(huán)境為非缺氧狀態(tài)，HIF-1α蛋白被降解。但是隨著腫瘤組織不斷生長，腫瘤細胞微環(huán)境逐漸轉變由有氧環(huán)境轉變?yōu)槿毖醐h(huán)境，腫瘤細胞中HIF-1基因活化增強并伴有HIF-1蛋白降解減弱。HIF-1α蛋白促進了腫瘤細胞增殖和血管形成，并促進了腫瘤的淋巴結轉移[10-11]。但HIF-1蛋白與腫瘤演進的分子機制有待進一步研究證實。

CD147基因定位于19p13.3號染色體，CD147是一種54kDa糖基化跨膜蛋白，CD147通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和細胞因子的分泌，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和腫瘤細胞遷移、轉移和分化及腫瘤耐藥性的形成等重要功能[12]。CD147是促進腫瘤侵襲、生長、進展和轉移的核心。大量研究證實CD147的過度表達與腫瘤進展、轉移發(fā)展和耐藥性等現(xiàn)象之間的相關性[4]。此外在一組入組328例結直腸癌患者的研究應用免疫組織化學方法檢測結直腸癌組織中CD147的表達，采用統(tǒng)計學分析評價CD147表達與結直腸癌患者無疾病生存率的關系，結果顯示CD147在結直腸癌中表達增加(P<0.001)，與腫瘤侵襲(P<0.001)、轉移(P<0.001)和TNM分期(P<0.001)有關，這些結果提示CD147在人類結直腸癌復發(fā)中的潛在作用，這可能是預測結直腸癌復發(fā)的一種新的分子標記物[13]。本研究通過對本組37例的結直腸癌組織中CD147檢測發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中CD147表達明顯高于正常組織，同時結直腸癌組織中CD147的高表達與腫瘤大小和淋巴結轉移比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究結果與既往研究相似，表明CD147在結直腸癌組織中是一個非常關鍵的因子，可能參與腫瘤的進展和轉移[14]。在本組病例中未觀察到CD147與腫瘤侵襲性指標，如神經(jīng)侵犯，脈管侵犯等，以及腫瘤TNM分期的相關性，可能與入組病例數(shù)較少有關。

MMPS是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，由25個成員組成，MMP家族成員MMP-9起著關鍵的蛋白酶作用，MMP-9蛋白一旦被激活，MMP-9蛋白就能夠降解許多細胞外基質(zhì)[15]。Jeroen等[16-17]通過免疫組織化學染色檢測507例結直腸癌患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)MMP-9過度表達與腫瘤細胞過度增殖、細胞凋亡、血管生成及腫瘤侵襲轉移密切相關。并發(fā)現(xiàn)在原發(fā)結直腸癌和未接受系統(tǒng)治療的腫瘤組織中MMP-9蛋白的高表達，具有評估預后的價值，是早期檢測結直腸癌復發(fā)、轉移和預后的生物標志物[18]。本研究結果顯示，37例結直腸癌組織中，MMP-9蛋白在結直腸癌腫瘤組織中陽性率為54.1%(20/37)，在正常對照組中為16.2%(6/37)，MMP-9蛋白在腫瘤組織表達明顯高于正常組織，MMP-9蛋白表達與淋巴結轉移比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示高水平的MMP-9蛋白促進細胞周圍基質(zhì)降解，有助于腫瘤細胞突破細胞外基質(zhì)的屏障作用，向周圍的脈管發(fā)生浸潤和轉移，可見MMP-9蛋白在介導腫瘤細胞惡性生物學行為過程中起到重要的作用[19]。

HIF-1α通過誘導數(shù)百個基因的轉錄，在腫瘤的生長和惡性進展中發(fā)揮重要作用，這些基因在提高腫瘤組織中的氧利用率并誘導血管生成、使腫瘤細胞擺脫缺氧并促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，以及癌細胞對缺氧微環(huán)境的適應(代謝重編程)[6]。CD147表達上調(diào)后能促進腫瘤生長，抑制腫瘤細胞凋亡，增強其缺氧侵襲能力[20]。CD147刺激對MMP降解細胞外基質(zhì)并導致腫瘤的生長、侵襲和轉移具有重要意義[15]。本研究結果顯示，在結直腸癌腫瘤組織中，HIF-1α、MMP-9、CD147蛋白表達之間互相呈正相關(P<0.05)。

綜上所述，綜合已有國內(nèi)外研究結果結合本研究結果，本研究認為HIF-1α、CD147、MMP-9蛋白表達與結直腸癌發(fā)生和發(fā)展是有著密切的關系，即HIF-1α基因轉錄活化，癌細胞對缺氧微環(huán)境的適應，同時提高腫瘤組織中的氧利用率、誘導血管生成、腫瘤細胞的侵襲和轉移能力增強；同時HIF-1α基因轉錄活性增強后，對CD147啟動子激活的介導作用加強，CD147刺激對MMP-9降解細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移以及耐藥性產(chǎn)生[21]。但HIF-1α、CD147和 MMP-9 3種分子在信號傳導通路上相互作用和相互關系的分子機制，有待進一步深入研究。