基于共軛物的酸性水解
——利用萃取-衍生化-GC/MS分析人尿中17-酮類固醇

高 原

(中國刑事警察學(xué)院，遼寧 沈陽 110854)

在犯罪調(diào)查取證中，尿液是重要的檢材。但在犯罪現(xiàn)場上，不能確定尿液來源于受害者或者案發(fā)相關(guān)人，需要對尿液的來源進(jìn)行判定。因此人和動物的尿液鑒定，在刑事科學(xué)方面很重要。以前的人尿證明是通過尿酸檢測來進(jìn)行的。但尿酸有時不能成為人尿的證明指標(biāo)，因?yàn)轼B類的糞便中含有尿酸，犬類中的達(dá)爾馬提亞狗也會在尿液中排泄尿酸[1]。因此我們認(rèn)為，對人尿中17-酮類固醇(17-KS)的雄酮(A-n)、本膽烷醇酮(Eti)、脫氫表雄酮(DHEA)的檢驗(yàn)是一種能夠有效鑒定人和動物尿液的方法[2]。

對于刑事科學(xué)檢驗(yàn)中的17-KS分析，主要有GC-MS法與LC-MS法。而相較于LC-MS，GC-MS的設(shè)備更易操作，且市面上的質(zhì)譜庫也很豐富，因此通過GC-MS進(jìn)行的尿中17-KS分析雖然需要花費(fèi)時間進(jìn)行水解和衍生化反應(yīng)，但仍可以說是一種更為實(shí)用的分析方法。

尿中17-KS共軛物的水解可以通過酶法和酸法進(jìn)行。酶法水解反應(yīng)特異性強(qiáng)，但反應(yīng)時間長且費(fèi)用高。而酸法水解反應(yīng)時間短且費(fèi)用低，并且未見關(guān)于17-KS共軛物的酸性水解的研究報告。所以，本實(shí)驗(yàn)以人尿?yàn)闃悠罚瑢τ糜贕C-MS分析的17-KS共軛物的酸性水解條件進(jìn)行研究。另外，本實(shí)驗(yàn)通過GC-MS分析中常用的衍生化方法，將萃取物干燥后進(jìn)行反應(yīng)。有報告提到了使用七氟丁酰氯(HFB-Cl)同時進(jìn)行衍生化和萃取的萃取-衍生化法[3-4]。而這些報告介紹了在固相萃取時向洗脫液內(nèi)添加衍生化試劑的方法，沒有研究其在液-液萃取中的應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)對該方法能否應(yīng)用于液-液萃取進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

An、Eti、DHEA、DHEA的硫酸共軛物和葡萄糖醛酸共軛物標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，含有1%三甲基氯硅烷的N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)(SPELCO公司)，HFB-Cl(Aldrich公司)，七氟丁酸酐(HFBA)(Pierce公司)。

5名健康成年男性(年齡25～55歲)和3名健康成年女性(年齡25～50歲)提供的0.2ml尿液施放到1×1cm的棉布上制成的尿斑。

GC檢測器(Thermo Fisher Scientific公司)，DB -5MS(30m×0.25mm ID，膜厚0.25μm)，質(zhì)譜檢測器(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸性水解條件的研究

在制成的尿斑上加1mL蒸餾水，超聲處理5min，在500μL的提取液中加入500μL鹽酸，使其最終濃度達(dá)到1.5%,3%,7%。將含有不同濃度鹽酸的提取液在60℃、80℃、100℃下加熱20min進(jìn)行水解。然后，將市售濃鹽酸濃度設(shè)為36%，計(jì)算出鹽酸濃度。通過對反應(yīng)時間10,20,30,40,50,60min進(jìn)行研究，得到An、Eti和DHEA共軛物的最佳水解時間。水解后，在反應(yīng)液中加入氨水進(jìn)行中和，用2mL氯仿萃取2次。使用無水硫酸鈉將萃取液脫水后進(jìn)行減壓蒸發(fā)干燥，對萃取物中的17-KS進(jìn)行TMS衍生化和GC-MS分析。進(jìn)行TMS衍生化時，在干燥的氯仿萃取物中加入含有1%三甲基氯硅烷的50μl三氟乙酰胺(BSTFA)，用鋁制加熱器在70℃下反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)液冷卻到室溫(約25℃)后，測量水解后產(chǎn)生的An量、Eti量和DHEA量。在所有條件下進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.2 使用HFB-Cl進(jìn)行萃取-衍生化的條件研究

分別取An、Eti、DHEA的標(biāo)準(zhǔn)品各500ng，加入1mL的水制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按以下條件對該溶液進(jìn)行萃取-衍生化。在全部條件下實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.2.1 萃取溶劑的研究

在1mL的An、Eti和DHEA各標(biāo)準(zhǔn)品的500ng/mL水溶液中加入2mL含有5% HFB-Cl的6種溶劑(正己烷、丁基氯、甲苯、二乙醚、乙酸乙酯和氯仿)的任一種，在室溫下用漩渦混合器攪拌2min。分取有機(jī)層后，在水層中再次加入2mL含有相同試劑的同種溶劑，攪拌2min。將獲得的有機(jī)溶劑層調(diào)和，用無水硫酸鈉進(jìn)行脫水，通入氮?dú)鈱⑷軇┱麴s去除后，溶解到100μL的乙酸乙酯中，進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2.2 HFB-Cl濃度的研究

為了確定衍生化試劑HFB-Cl的最佳濃度，在1mL的An、Eti和DHEA各標(biāo)準(zhǔn)品的500ng/mL水溶液中添加2mL的正己烷，使HFB-Cl的最終濃度能夠達(dá)到1%,2%,3%,4%,5%,7%和10%，進(jìn)行萃取-衍生化反應(yīng)和GC-MS分析。

1.2.2.3 pH值的影響

為了確定反應(yīng)溶液的pH值對萃取-衍生化反應(yīng)效率的影響，對50mM鄰苯二甲酸緩沖溶液(pH4)、100mM磷酸緩沖溶液(pH值=6和pH值=8)、10mM硼酸緩沖溶液(pH值=10)和0.1M NaOH進(jìn)行稀釋，將pH值調(diào)整到pH值=12，用該水溶液調(diào)配出1mL的An、Eti和DHEA各標(biāo)準(zhǔn)品的500ng/mL溶液，用含有5%HFB-Cl的2 mL正己烷進(jìn)行萃取-衍生化反應(yīng)和GC-MS分析。

1.2.3 HFB-Cl萃取-衍生化效率的計(jì)算

取An、Eti和DHEA各500ng，加入50μL的HFBA并進(jìn)行密封，在70℃下加熱30min。反應(yīng)后，通入氮?dú)鈱⑷軇┱麴s去除，然后溶于100μL的乙酸乙酯中進(jìn)行GC-MS分析。取含有等量An、Eti和DHEA的水溶液1mL，按照上述方法用HFB-Cl進(jìn)行萃取-衍生化反應(yīng)和GC-MS分析，用不同方法獲得HFB衍生物的峰面積比，從中計(jì)算出萃取-衍生化效率。

1.2.4 檢測靈敏度的研究

在標(biāo)準(zhǔn)品An、Eti和DHEA中添加1mL水調(diào)配出溶液，在確定條件下進(jìn)行萃取-衍生化反應(yīng)和GC-MS分析，調(diào)查檢測靈敏度。以S/N比為5的濃度作為檢測限。

1.3 GC-MS 條件

柱溫：200℃→280℃(5℃/min)；載氣：氦氣(流量0.7 mL/min)；入口溫度：260℃；分流比：20∶1；電離法：電子電離法；測量模式：掃描模式(檢測范圍m/z 50～500)。

根據(jù)TMS衍生物條件下m/z 272(An)、m/z 257(Eti)、m/z 129(DHEA)和HFB衍生物條件下m/z 442(An)、m/z 442(Eti)、m/z 270(DHEA)的各衍生物基峰面積進(jìn)行定量。 HFB衍生物在該條件下的檢測限：An為15ng/mL，Eti為8ng/mL，DHEA為50ng /mL。

1.4 對模擬鑒定資料的運(yùn)用

按照1.2.1的方法對取自5名成年男性和3名成年女性的尿斑中含有的An、Eti和DHEA進(jìn)行水解，然后按照1.2.2的方法進(jìn)行分析。但水解的鹽酸濃度為6%，反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時間20分鐘，HFB-Cl的濃度為5%，萃取溶劑采用了正己烷。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性水解條件的研究

An、Eti和DHEA各共軛物的酸性水解的溫度和鹽酸濃度關(guān)系如圖1所示。對比鹽酸濃度為1.5%和3%的情況，通過尿中An共軛物水解得到的游離An在3%條件下的生成量更多，且生成量會隨著反應(yīng)溫度的升高而增加。但在鹽酸濃度為7%的情況下，對比反應(yīng)溫度為60℃和80℃的情況，游離An在溫度較高的80℃條件下的生成量會增加，但在100℃條件下的生成量反而比80℃時有所減少。關(guān)于Eti的水解，在鹽酸濃度為1.5%、3%、7%的情況下，游離Eti的生成量都會隨著反應(yīng)溫度的升高而增加。而另一方面，游離DHEA在60℃的水解溫度條件下幾乎檢測不到，當(dāng)溫度為80℃，鹽酸濃度為3%和7%時可以確認(rèn)游離DHEA的生成量。當(dāng)溫度為100℃時，無論是何種鹽酸濃度都可以確認(rèn)游離DHEA的生成量，但在鹽酸濃度為7%、溫度為80℃的條件下游離DHEA生成量出現(xiàn)下降。因此，我們認(rèn)為水解的有效條件是3%鹽酸濃度和100℃加熱溫度。

圖1 An、Eti和DHEA各共軛物水解產(chǎn)量與HCI濃度、反應(yīng)溫度關(guān)系圖

圖2 An、Eti和DHEA各共軛物水解產(chǎn)量與反應(yīng)時間關(guān)系圖

接下來，我們研究了An、Eti和DHEA共軛物在3%鹽酸濃度和100℃加熱溫度條件下的水解時間，其結(jié)果如圖2所示。可以看出，游離An量和Eti量在反應(yīng)的前30min均會一直增加，在反應(yīng)30min之后出現(xiàn)減少。另一方面，游離DHEA在反應(yīng)的前20min會一直增加，然后減少。 An和DHEA的減少趨勢更為明顯。因此我們認(rèn)為，3%的鹽酸濃度、100℃的加熱溫度、20min的反應(yīng)時間是比較適宜的。

2.2 采用HFB-Cl進(jìn)行萃取-衍生化的方法研究

2.2.1 萃取溶劑的研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用二乙醚、乙酸乙酯、氯仿檢測不出衍生物。同時確認(rèn)可以通過正己烷、丁基氯、甲苯進(jìn)行萃取-衍生化，且使用正己烷時的萃取-衍生化效率最高。

2.2.2 HFB-Cl濃度的研究

本實(shí)驗(yàn)研究使用各種濃度的HFB-Cl對500ng的各成分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行萃取-衍生化時發(fā)現(xiàn)，An的峰面積在HFB-Cl濃度達(dá)到5%之前一直增加，但之后沒有觀察到明顯差異，Eti的峰面積在HFB-Cl濃度達(dá)到4%之前一直增加，在5%以后沒有觀察到明顯差異。另外，DHEA的峰面積受HFB-Cl濃度的影響不大，但4%～7%左右比較適宜(圖3)。綜上，HFB-Cl濃度定為5%。

圖3 HFB-Cl濃度對17-KS衍生化的影響

2.2.3 樣品溶液的pH值的影響

將樣品溶液從pH值=4調(diào)整到pH值=12，研究樣品溶液的pH值對5%HFB-Cl/正己烷的萃取-衍生化的影響。發(fā)現(xiàn)萃取-衍生化效率在pH值=8處最高(圖4)。

圖4 pH值對17-KS衍生化的影響

2.3 對模擬鑒定資料的運(yùn)用

用5名成年男性(年齡25歲～55歲)和3名成年女性(年齡25歲～50歲)提供的尿液制成尿斑作為模擬鑒定資料，進(jìn)行17-KS分析，確認(rèn)峰值處顯示的保留時間和質(zhì)譜同來自所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)品An、Eti和DHEA的HFB衍生物相同，分別對尿液中的An、Eti和DHEA進(jìn)行類別確定。以其中1人(29歲 男性)的分析結(jié)果為例，如圖5所示。

圖5 人尿中17-KS的分析結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用GC-MS對人尿中17-酮類固醇進(jìn)行分析，通過對鹽酸濃度、加熱溫度、加熱時間、衍生化試劑濃度、pH值等條件進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)在3%鹽酸濃度、100℃溫度、20min加熱時間的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果最好。同時對萃取-衍生化反應(yīng)中的溶劑進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，使用正己烷時的效率最高。另外，使用該方法對取自不同年齡和不同性別的8名成年人的尿斑進(jìn)行了分析，An、Eti和DHEA這三種成分全部被檢測出來。因此該方法作為人尿中17-KS分析法是有效的。