脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)不同牛舍中大腸桿菌的分析鑒定

文/李慶雷 王金新 劉 鵬 付 嵩 馬 馳

（山東高速生物工程有限公司）

2020年初，一場(chǎng)史無(wú)前例的新冠肺炎疫情嚴(yán)重影響了全球，公共生物衛(wèi)生安全引起重大關(guān)注，未來(lái)，生物安全極有可能越來(lái)越頻繁地威脅人類公共衛(wèi)生安全。生物安全防控過(guò)程中，最難控制的傳播途徑就是病原微生物的氣溶膠傳播，尤其是導(dǎo)致人畜共患病的病原菌傳播控制難度大，危害性強(qiáng)。

現(xiàn)代集約化奶牛場(chǎng)中，奶牛糞便中的微生物擴(kuò)散到空氣中，形成微生物氣溶膠，具有濃度高、分布廣、擴(kuò)散快的特征，能導(dǎo)致氣源性傳染病的傳播，嚴(yán)重威脅工作人員健康、奶牛生產(chǎn)性能及健康[1]，甚至導(dǎo)致某些傳染病的暴發(fā)流行。在奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中，大腸桿菌引起的奶牛疾病較常見(jiàn)[2]，奶牛乳房炎和犢牛腹瀉等疾病都與大腸桿菌感染密切相關(guān)[3]，對(duì)牧場(chǎng)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，且大腸桿菌還是人畜共患病原菌，因此，對(duì)大腸桿菌氣溶膠傳播方式的研究非常重要。

本文分別在泌乳牛舍、青年牛舍和犢牛舍收集空氣樣品，進(jìn)行分離培養(yǎng)，利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）[4]技術(shù)對(duì)采集到的大腸桿菌進(jìn)行同源性分析[5]，探討大腸桿菌的來(lái)源，分析奶牛舍之間大腸桿菌氣溶膠的傳播方式。

1 材料和方法

1.1 空氣樣品采集

2019年10月，從山東濟(jì)南某現(xiàn)代化奶牛場(chǎng)采集樣品，該奶牛場(chǎng)有8 棟開(kāi)放式牛舍。開(kāi)放式奶牛舍長(zhǎng)110.0 m，寬27.0 m，高6.0 m，舍內(nèi)溫度為15～23 ℃，濕度為48%～57%，每日機(jī)械清理糞便5次，舍外溫度為15～23 ℃，濕度為46%～54%，風(fēng)速為0。分別對(duì)其中1 棟泌乳牛舍（飼養(yǎng)奶牛240 頭）、1 棟發(fā)育牛舍（飼養(yǎng)6～14 月齡奶牛280 頭）和1 棟犢牛舍（飼養(yǎng)3～6月齡奶牛320 頭）采集空氣樣品。

1.2 氣載大腸桿菌的收集

采用Andersen-6級(jí)[6]空氣微生物樣品收集器，氣流速度28.3 L/min，設(shè)置于奶牛舍中央，采樣時(shí)間5 min，重復(fù)采樣5 次。

1.3 糞便中大腸桿菌的分離與鑒定

無(wú)菌收集新鮮的糞便樣本每舍15 個(gè)，取1 g糞便，放入盛有9 mL滅菌生理鹽水中稀釋，后接種到麥康凱3號(hào)培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)[7]，再?gòu)拿總€(gè)平板中挑取典型紅色菌落[8]，選用麥康凱3號(hào)培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)[9]，樣本在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，然后用API 20 E（Bio Merieux，Marcy-I，Etoile，F(xiàn)rance）鑒定大腸桿菌，最后將其放入含30%甘油的肉湯培養(yǎng)物中，-20 ℃保存[10]。

圖1 PFGE鑒定圖

1.4 對(duì)不同來(lái)源大腸桿菌進(jìn)行PFGE分型

參照美國(guó)CDC PulseNet USA對(duì)大腸桿菌分型的方法進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳[11]。首先制成細(xì)菌包埋塊，在54 ℃條件下細(xì)胞裂解2 h后，在37 ℃ XbaI酶切2 h，使用CHEF Mapper電泳儀，在1%SeaKem Gold Agarose（Lonza Rockland，ME USA）（Pharmacia Biotech）上跑電泳。電泳條件為溫度14 ℃，角度120°，脈沖時(shí)間5～60 s，電壓6 V/cm，電泳時(shí)間18 h[12]。電泳結(jié)束后，用紫外成像系統(tǒng)（Tanon-2500）拍照并保存。

圖2 大腸桿菌PFGE分析圖

2 結(jié)果

2.1 PFGE 電泳圖片

在采集的空氣樣品和糞便樣品中總計(jì)分離到9 株大腸桿菌，經(jīng)過(guò)PFGE電泳后，紫外凝膠成像儀上記錄下的PFGE凝膠圖片見(jiàn)圖1。

2.2 PFGE 結(jié)果判定

對(duì)于圖1，利用計(jì)算機(jī)分析軟件（Tanon-2500）記錄下擴(kuò)增及電泳譜帶。每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶存在時(shí)，賦值為“1”；不存在時(shí)，賦值為“0”，用電泳圖象分析軟件（Gel Image System，Version 4.00）進(jìn)行分析后自動(dòng)生成矩陣圖。運(yùn)用非加權(quán)對(duì)數(shù)算術(shù)平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），采用NTSYS-pc 2.10[13]軟件構(gòu)建聚類樹(shù)狀圖（圖2）。

由于細(xì)菌存在合理的變異性，判斷不同來(lái)源的菌株是否為同一菌株時(shí)允許有一定的變異存在。Tenover等[14]提出了有關(guān)菌株同源性的判別標(biāo)準(zhǔn)，按其電泳條帶可分為：無(wú)差異， 說(shuō)明為相同菌株；有1～3 條帶的差異說(shuō)明菌株間有相近關(guān)系，且只有單基因的改變；4～6 條帶的差異說(shuō)明菌株間可能有相近關(guān)系，表示出有2 個(gè)獨(dú)立基因的差異；如菌株間有6 條帶或更多條帶差異，說(shuō)明有3 個(gè)或更多基因的變化，被視為無(wú)相關(guān)性。該標(biāo)準(zhǔn)只適合于小量的局部性基因的變化研究，有一定的局限性。Tenover等在解釋PFGE結(jié)果時(shí)提出將具有85%以上相同條帶的菌株認(rèn)為是相同的菌株，50%以上的條帶不相同時(shí)，菌株被認(rèn)為流行病學(xué)不相關(guān)。

從圖1可以看出，有6 株菌株同源性高于85%，據(jù)此判定具有同源性，說(shuō)明大腸桿菌可以從糞便中傳播到空氣中，進(jìn)而在牛舍之間傳播。

3 討論

3.1 空氣微生物采樣方法

采用國(guó)際通用的微生物氣溶膠收集器，ANDERSEN-6級(jí)收集器收集空氣中的微生物氣溶膠，可采集到的粒譜范圍在0.2～20.0 m，采集到的活粒子數(shù)多，敏感性高，是一種非常準(zhǔn)確、有效的氣載微生物采樣方法。

3.2 同源性分析方法

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)分型技術(shù)，在微生物同源性分析上被應(yīng)用，比如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)（Rep-PCR）、腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR技術(shù)（Eric-PCR）、多重PCR技術(shù)（Multiplex-PCR）等，省時(shí)、省力、簡(jiǎn)單、快速且成本低，且對(duì)實(shí)驗(yàn)操作和儀器試劑要求不高，因此，被廣泛應(yīng)用到多種細(xì)菌的分型中。然而這些方法的分辨率以及重復(fù)性很難區(qū)分遺傳關(guān)系相近的菌株[10，15～17]。近幾年，PFGE以其重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)而被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[18～20]，在分型上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。Moissenet（1996）[18]、Stewart（1995）[19]等均已證實(shí)PFGE的分辨率和重復(fù)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ERIC-PCR等以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)分型技術(shù)，是鑒定病原微生物氣源性傳播的較理想技術(shù)。鑒于此，對(duì)不同來(lái)源的菌株進(jìn)行PFGE分型，比較其遺傳相似性，認(rèn)知細(xì)菌的來(lái)源，從根本上確認(rèn)奶牛舍之間微生物氣溶膠傳播方式。

4 小結(jié)

大腸桿菌在奶牛舍及其周圍環(huán)境中是一種常見(jiàn)菌。Hojovec等（1977）[8]曾將大腸桿菌作為評(píng)估畜禽舍空氣質(zhì)量的指示細(xì)菌。運(yùn)用PFGE分型方法，通過(guò)比較泌乳牛糞便和不同牛群舍內(nèi)氣載大腸桿菌的同源性發(fā)現(xiàn)，從泌乳牛的糞便中分離的大腸桿菌與泌乳牛舍和小牛舍空氣中分離到的大腸桿菌有2 株（占總數(shù)量23%）相似性可達(dá)85%以上，因此，推測(cè)奶牛糞便中的大腸桿菌可以形成氣溶膠污染奶牛舍空氣。但是，某些從舍內(nèi)空氣中分離到的大腸桿菌與糞便中的相似性較小，出現(xiàn)這種結(jié)果一方面，可能是舍內(nèi)分離到的大腸桿菌確實(shí)不是來(lái)源于糞便；另一方面，采集的糞便樣本有限，沒(méi)有分離到與空氣中同源的大腸桿菌；或者是這些大腸桿菌來(lái)源于其他方面，如飼料、墊料或飲水等。

結(jié)果表明，從泌乳牛的糞便中分離的大腸桿菌能夠?qū)Νh(huán)境造成生物污染，在泌乳牛舍中形成環(huán)境微生物氣溶膠，并隨空氣傳播，對(duì)奶牛環(huán)境性疾病的防控及環(huán)境消毒具有理論指導(dǎo)作用，并具有公共衛(wèi)生學(xué)意義。