發(fā)酵冬蟲夏草菌粉中蟲草多糖的含量測(cè)定及其抗輻射作用初探※

楊建鑫，年永瓊，段雅彬，辛元堯，朱 琳，劉貴琴，李向陽(yáng)，5*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海民族大學(xué)，青海 西寧 810007；3.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435；4.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；5.三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體，主要產(chǎn)自青藏高原，活性成分包括蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、甾醇以及脂肪酸和氨基酸等。國(guó)內(nèi)外對(duì)冬蟲夏草藥理作用的研究主要集中在其抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用等方面，對(duì)其抗輻射作用的報(bào)道較少，其中有研究顯示發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體能夠顯著提高致死劑量輻射后小鼠的存活率，加速白細(xì)胞恢復(fù)并刺激免疫淋巴細(xì)胞增殖[1]。蟲草多糖是從蟲草子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液中提取分離得到的一種真菌多糖，為冬蟲夏草的主要活性成分之一，具有抗氧化、保護(hù)造血系統(tǒng)及免疫調(diào)節(jié)作用。近年來，由于人類過度采挖造成天然冬蟲夏草資源嚴(yán)重匱乏，目前蟲草多糖的來源主要依賴于發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體和發(fā)酵液。有研究顯示蟲草多糖對(duì)紫外線B輻射誘導(dǎo)的人體皮膚細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用[2]。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖可通過減少氧化損傷和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-17的分泌，增強(qiáng)60Coγ射線輻射小鼠的免疫活性。本研究通過測(cè)定發(fā)酵冬蟲夏草菌粉中多糖的含量，觀察存活率，檢測(cè)外周血象，計(jì)算胸腺及脾臟的臟器指數(shù)，測(cè)定骨髓DNA含量探討蟲草多糖的抗輻射作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

發(fā)酵冬蟲夏草菌粉(FermentedCordycepssinensispowder。蝙蝠蛾被毛孢菌絲體，批號(hào)：ZF0418F002)購(gòu)自青海珠峰冬蟲夏草保健品有限公司；蟲草多糖(Cordycepssinensispolysaccharides，CSP。批號(hào)：C03A9Y57641，含量88.09%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；氨磷汀(批號(hào)：J0311A)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

23EX醫(yī)用電子直線加速器購(gòu)自美國(guó)VaRian公司；Sysmex XN-10(B1)全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀購(gòu)自日本希森美康株式會(huì)社；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；BT224S電子分析天平購(gòu)自德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器公司；TGL-16gR高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠(6～8 w，18～22 g)購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。分籠飼養(yǎng)(日光光照明暗交替，自由飲食飲水)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組與給藥方法

將小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組，輻射模型組，陽(yáng)性對(duì)照組(氨磷汀，150mg/kg)，蟲草多糖低劑量組(100mg/kg)、蟲草多糖中劑量組(200mg/kg)、蟲草多糖高劑量組(400mg/kg)。蟲草多糖各組每日以灌胃方式予相應(yīng)劑量(20mL/kg)藥物，正常對(duì)照組、輻射模型組以灌胃方式予等體積生理鹽水(0.3mL)，連續(xù)14 d后進(jìn)行照射，陽(yáng)性對(duì)照組于照射前30 min于腹腔注射氨磷汀溶液。

1.5 蟲草多糖含量測(cè)定方法

1.5.1 供試品溶液

精密稱取1.0 g干燥的發(fā)酵冬蟲夏草菌粉，按料液比1：20(g/mL)加入20 mL水，溶解1 h后，水浴(90℃)浸提110 min，浸提3次，真空過濾后合并提取液并濃縮至1/3體積。隨后在濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，劇烈攪拌，靜置過夜(4℃)。離心(8000g)30 min，棄去上清液，將沉淀物干燥(65℃)至恒重。加水溶解并定容至50 mL，而后取1 mL加水定容至25 mL，作為供試品溶液備用。

1.5.2 對(duì)照品溶液

精密稱定0.010 g葡萄糖，加水溶解定容至100 mL配制成100 mg/L的葡萄糖溶液，作為對(duì)照品溶液備用。

1.5.3 線性關(guān)系

精密量取對(duì)照品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，用水補(bǔ)足至每管2 mL，緩慢加入7.0 mL 98%的濃硫酸，搖勻，恒溫放置1 h，加入1.0 mL 4%的苯酚溶液，搖勻，水浴(40℃)35 min后行冰水浴5 min，取出放置20 min，使用紫外-可見分光光度計(jì)全波段掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，而后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

1.5.4 精密度

精密量取供試品溶液1.0 mL，加入1.0 mL水，按1.5.3項(xiàng)下所示最佳條件顯色并測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次，計(jì)算RSD值。

1.5.5 穩(wěn)定性

精密量取供試品溶液1.0 mL，加入1.0 mL水，按1.5.3項(xiàng)下所示最佳條件顯色并測(cè)定吸光度，每10 min測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定2 h，計(jì)算RSD值。

1.5.6 重復(fù)性

精密量取6份供試品溶液，按1.5.3項(xiàng)下所示最佳條件顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.5.7 加樣回收率

精密量取供試品溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，分別精密加入葡萄糖對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，用水補(bǔ)足至每管2 mL，按1.5.3項(xiàng)下所示最佳條件顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。

1.5.8 樣品含量

取6份供試品溶液，按1.5.3項(xiàng)下所示最佳條件顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。樣品中多糖含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，單位以百分比表示，按如下公式計(jì)算：

m1：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定液中含糖量，單位為μg；V1：樣品定容體積，單位為mL；m2：樣品質(zhì)量，單位為g；V2：比色測(cè)定時(shí)所移取樣品測(cè)定液的容積，單位為mL；0.9：葡萄糖換算葡聚糖的校正系數(shù)。

1.6 存活率測(cè)定方法

按1.4項(xiàng)下所示方法分組并給藥，每組10只小鼠，除正常對(duì)照組外其余各組小鼠采用醫(yī)用電子直線加速器X射線予全身一次性照射(TBI)，照射劑量12 Gy(吸收劑量率300cGy/min，時(shí)間240s，視野40×40cm，源皮距100cm)。照后連續(xù)觀察30 d小鼠的生存狀態(tài)。

1.7 指標(biāo)測(cè)定方法

按1.4項(xiàng)下所示方法分組并給藥，每組10只小鼠，除正常對(duì)照組外其余各組小鼠的照射劑量為5 Gy TBI(吸收劑量率300cGy/min，時(shí)間100s，視野40×40cm，源皮距100cm)。

1.7.1 外周血象

各組小鼠在照射后第1、3、5 d時(shí)從眼底靜脈叢取血20 μL置含有EDTA-2Na的抗凝管中，取全血用血細(xì)胞分析儀在預(yù)稀釋模式下檢測(cè)外周血象。

1.7.2 臟器指數(shù)

于照后第5 d時(shí)取各組小鼠胸腺、脾臟，除去血漬，用濾紙吸干后稱重，計(jì)算相應(yīng)臟器指數(shù)(%)：[臟器質(zhì)量(g)/動(dòng)物體重(g)]×100%。

1.7.3 骨髓DNA含量的測(cè)定

于照后第5 d時(shí)取各組小鼠右側(cè)股骨，剝離肌肉組織后剪斷第二股骨，用10 mL CaCl2(0.005mol/L)溶液將骨髓沖入離心管中，重復(fù)沖洗多次后將骨髓液放置(4℃)30 min，隨后離心(2500r/min)15 min，棄上清液取沉淀物加入5 mL HClO4(0.2mol/L)酸化，充分混勻后水浴(90℃)加熱15 min，用流水冷卻、濾紙過濾，濾液用紫外-可見分光光度計(jì)在260 nm處測(cè)定吸光度(A值)，以該值確定骨髓DNA含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵冬蟲夏草菌粉中多糖的含量測(cè)定

2.1.1 線性關(guān)系考察

利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波段(200～800nm)掃描，最終確定最大吸收波長(zhǎng)為480 nm，因此在480 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程為Y=0.0076X+0.0165，線性范圍為10～100 μg，相關(guān)系數(shù)r=0.999(P<0.05)，表明葡萄糖在10～100 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 1 Standard curve of glucose

2.1.2 精密度

精密量取供試品溶液在最佳顯色條件下平行測(cè)定6次后，測(cè)得吸光度為0.113±0.002，RSD值為1.58%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

精密量取供試品溶液，在最佳顯色條件下每10 min測(cè)定一次吸光度，連續(xù)測(cè)定2 h，測(cè)得吸光度為0.110±0.001，RSD值為1.20%，表明在10～120 min內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性

精密量取6份供試品溶液后，在最佳顯色條件下測(cè)得吸光度為0.108±0.001，RSD值為1.31%，表明重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收率

精密量取供試品溶液在最佳顯色條件下測(cè)得結(jié)果見表1，平均回收率為97.72%，RSD值為2.53%，表明回收率滿足要求。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Results of recovery test

2.1.6 樣品的含量

精密量取6份供試品溶液在最佳顯色條件下測(cè)定吸光度后，最終計(jì)算得到樣品中多糖的平均含量為1.35%。

2.2 蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠存活率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，輻射組小鼠經(jīng)X射線照射后飲食減少、體重減輕、皮毛光澤減退、行動(dòng)遲緩且精神萎靡；蟲草多糖處理各組小鼠照射后體征有所改善，30 d內(nèi)存活率和存活時(shí)間也明顯提高。與正常組相比，輻射組小鼠存活率顯著下降(P<0.05)；與輻射組相比，蟲草多糖中劑量組存活率有明顯提高(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠存活率的影響值(%)

Table 2 Effect of CSP on survival rate in radiation-injured mice(%)

圖2 蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠存活率的影響圖

Figure 2 Effect of CSP on survival rate in radiation-injured mice

2.3 蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠指標(biāo)的影響

2.3.1 蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠外周血象的影響

與正常組比較，輻射組小鼠WBC、RBC及HGB數(shù)目均有所下降，而PLT數(shù)目在照射后升高，其中WBC數(shù)目在照射后第1、3、5 d時(shí)顯著降低了72.03%、85.31%、88.81%(P<0.05)，PLT數(shù)目在照射后第3 d時(shí)顯著升高了28.24%(P<0.05)；與輻射組比較，蟲草多糖中劑量組在照射后第3 d時(shí) WBC顯著升高了59.65%(P<0.05)，蟲草多糖低劑量組在照后第3、5 d時(shí) PLT顯著降低了22.84%、24.43%(P< 0.05)，見表3～5。

組別nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PLT(109/L)正常對(duì)照組102.86±0.4511.28±0.25173.33±4.26386.67±58.50輻射模型組100.80±0.09#10.24±1.14151.33±15.76480.67±70.01陽(yáng)性對(duì)照組100.81±0.0410.79±0.16169.83±3.20438.67±86.99CSP低劑量組100.88±0.1011.38±0.30170.00±5.07580.00±45.04CSP中劑量組100.86±0.0411.91±0.35187.33±5.18519.67±71.13CSP高劑量組100.88±0.0411.80±0.32175.00±4.14519.83±19.42F- 18.305 1.407 2.345 1.194P- <0.001 0.250 0.065 0.336

#：與正常對(duì)照組比較，P<0.05

組別nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PLT(109/L)正常對(duì)照組103.88±0.2611.69±0.78171.75±11.76777.62±64.28輻射模型組100.57±0.07#11.76±0.56174.75±8.52997.25±72.67#陽(yáng)性對(duì)照組100.59±0.0611.18±0.72168.25±10.41791.75±61.88?CSP低劑量組100.45±0.0310.60±0.54158.38±8.72769.50±59.84?CSP中劑量組100.91±0.06?12.96±0.80190.12±9.53907.75±85.00CSP高劑量組100.54±0.0412.59±0.53188.62±7.71885.12±68.68F- 129.968 1.715 1.642 1.720P- <0.001 0.150 0.170 0.151

#：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；*：與輻射模型組比較，P<0.05

組別nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)PLT(109/L)正常對(duì)照組104.11±0.227.01±0.27104.25±4.08722.50±32.91輻射模型組100.46±0.08#6.19±0.4891.13±6.71885.75±75.79陽(yáng)性對(duì)照組100.68±0.065.94±0.3091.00±4.28567.00±85.49?CSP低劑量組100.61±0.076.39±0.3597.25±5.28669.38±38.59?CSP中劑量組100.54±0.075.79±0.5485.75±7.80871.00±56.67CSP高劑量組100.35±0.036.34±0.4097.63±6.22684.75±110.38F-196.384 1.129 1.230 2.956P-<0.001 0.360 0.312 0.022

#：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；*：與輻射模型組比較，P<0.05

2.3.2 蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠臟器指數(shù)及骨髓DNA含量的影響

與正常組比較，輻射組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及骨髓DNA的含量均顯著降低了47.68%、58.90%、63.86%(P<0.05)；與輻射組比較，蟲草多糖各組胸腺及脾臟指數(shù)均有所升高，中劑量組對(duì)脾臟及胸腺的改善結(jié)果較好，分別升高了69.62%、30.00%(P<0.05)，而骨髓DNA含量均有上升趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表6。

組別n胸腺指數(shù)(%)脾臟指數(shù)(%)骨髓DNA(A)正常對(duì)照組100.151±0.0070.219±0.0120.570±0.034輻射模型組100.079±0.012#0.090±0.003#0.206±0.012#陽(yáng)性對(duì)照組100.070±0.0040.098±0.0050.283±0.023?CSP低劑量組100.080±0.0070.108±0.0030.220±0.015CSP中劑量組100.134±0.006?0.117±0.008?0.217±0.015CSP高劑量組100.125±0.0140.101±0.0050.211±0.043F- 14.509 48.381 29.593P- <0.001 <0.001 <0.001

#：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；*：與輻射模型組比較，P<0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體中多糖含量為1.35%。以往研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵冬蟲夏草菌粉中多糖的平均含量為3.848%，天然冬蟲夏草中多糖的含量為2.24%～3.59%[4]，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得發(fā)酵冬蟲夏草菌粉中多糖的含量低于文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)可能與提取時(shí)間及提取條件有關(guān)，因此今后應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化蟲草多糖的提取條件，以提高提取率及純度。

電離輻射可顯著影響機(jī)體的造血、免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)，對(duì)造血系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)在對(duì)骨髓造血干細(xì)胞、造血基質(zhì)細(xì)胞的抑制和破壞，以及對(duì)外周血細(xì)胞的影響等；對(duì)免疫系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為免疫活性淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失常、抗體形成抑制，最終導(dǎo)致免疫功能障礙和低下，引發(fā)一系列并發(fā)癥[5]。在臨床上，約50%的深部腫瘤需要用6 MV或以上的高能X射線進(jìn)行放射治療，但放療引起的損傷嚴(yán)重影響其療效及患者的生存質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)在照射劑量較低的全身一次性照射下，冬蟲夏草熱水提取物可保護(hù)小鼠因輻射所致的骨髓型死亡，而這一作用主要是通過加速白細(xì)胞數(shù)目的恢復(fù)而實(shí)現(xiàn)的[6]。本文結(jié)果同樣表明5 Gy X射線全身一次性照射可使小鼠WBC數(shù)目明顯下降，且隨照射后天數(shù)增加WBC數(shù)目的下降幅度增高，而蟲草多糖可在一定程度上提高WBC的數(shù)目。另有研究顯示機(jī)體在照射后，WBC、HGB數(shù)目會(huì)出現(xiàn)下降，但這種下降往往發(fā)生在照后較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，而PLT數(shù)目變化則不明顯[7]。臨床研究同樣表明長(zhǎng)期低劑量電離輻射會(huì)顯著增加外周白細(xì)胞的異常檢出率，而對(duì)血紅蛋白和血小板沒有顯著的影響[8]。這與本研究結(jié)果基本一致，在照射后第1、3、5天輻射組小鼠RBC、HGB以及PLT數(shù)目變化均不明顯。

研究表明，不同劑量的蟲草多糖能逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫器官萎縮，增強(qiáng)機(jī)體特異性體液免疫功能[9]。本研究結(jié)果顯示不同劑量的蟲草多糖對(duì)輻射損傷小鼠的胸腺及脾臟重量均有一定的增加作用，其中中劑量組能顯著提高兩種免疫器官的臟器指數(shù)。另外，輻射對(duì)機(jī)體造成的DNA損傷如本結(jié)果所示是較為嚴(yán)重的，但蟲草多糖對(duì)修復(fù)骨髓DNA損傷效果不明顯。

基于對(duì)蟲草多糖影響輻射損傷小鼠造血、免疫系統(tǒng)的研究，我們可以得出蟲草多糖可能是通過提高機(jī)體免疫達(dá)到對(duì)電離輻射的防護(hù)作用。存活率實(shí)驗(yàn)表明，小鼠在全身一次性照射(12Gy)下第5天開始出現(xiàn)死亡，而陽(yáng)性組及蟲草多糖組能提高輻射損傷小鼠的存活率和存活時(shí)間，且結(jié)果顯示蟲草多糖組的防護(hù)效果優(yōu)于陽(yáng)性藥物組，尤以中劑量組最佳，這與臟器指數(shù)、外周血象結(jié)果一致。