對破壁處理靈芝孢子粉功能特性的測定與分析

劉俊麗，崔清亮，張玉蕾，來思彤

（山西農(nóng)業(yè)大學 工學院，山西太谷 030801）

0 引言

靈芝孢子是靈芝的生殖細胞，它含有多糖、總?cè)?、脂肪酸等多種對人體有益的功能性成分［1］，其中多糖、三萜是其特有的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗癌及抗氧化等功效［2-4］，其含有的蛋白質(zhì)又富含人體所需的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、糖蛋白、凝集素及酶等［5］。有研究表明，靈芝孢子粉孢壁堅硬，功能性物質(zhì)被包裹在孢壁內(nèi)，很難被釋放出來［6］，直接食用未破壁的靈芝孢子粉，不易被人體消化吸收。

目前，對靈芝孢子粉的研究大多局限于某一種成分，黃曉蘭等［7］比較了破壁前后靈芝孢子粉的多糖溶出量，楊曉英等［8］比較了破壁前后靈芝孢子粉的總?cè)迫艹隽?。本文采用球磨法對靈芝孢子粉進行破壁處理，測定并分析破壁前后靈芝孢子粉基本營養(yǎng)成分、粗多糖和總?cè)频娜艹隽?，及其水、醇提取物的抗氧化性?/p>

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

材料：靈芝孢子粉由山西農(nóng)業(yè)大學食用菌中心提供。

試劑：葡萄糖（標準品，天津市致遠化學試劑有限公司）；苯酚（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；熊果酸（標準品，合肥博美生物科技有限責任公司）；香草醛（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；冰乙酸、乙酸乙酯和高氯酸（均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

TissueLyser Ⅱ球磨儀（德國凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司）；CMM-15E型透反射金相顯微鏡（上海長方光學儀器有限公司）；721N可見分光光度計（上海雙旭電子有限公司）；25×16型血球計數(shù)板（海門市春博生物實驗器材廠）。

2 試驗設計方法

2.1 靈芝孢子粉破壁率標準曲線繪制

稱量0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 g未破壁靈芝孢子粉，溶解并定容于50 mL容量瓶中。用血球計數(shù)板依次對已經(jīng)配制好的懸濁液進行計數(shù)。以靈芝孢子粉稱樣量為橫坐標，以對應的每個計數(shù)單位孢子的平均數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線［9］，得到標準曲線回歸方程為：

式中 y1——每個計數(shù)單位的孢子數(shù)，個；

x1——未破壁靈芝孢子粉稱樣量，g。

靈芝孢子粉破壁率以質(zhì)量分數(shù)（%）表示，結(jié)果按下式計算。

式中 N1—— 從標準曲線查到的與待測樣品相同質(zhì)量的未破壁孢子粉的個數(shù)；

N2—— 計數(shù)得到的破壁孢子粉樣品中未破壁的孢子粉的個數(shù)。

2.2 靈芝孢子粉基本營養(yǎng)成分測定

水分按照GB/T 5009.3-2016《食品中水分的測定》進行測定［10］；粗蛋白的測定按照國標GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法測定［11］，取樣量為0.50 g；粗脂肪測定按照國標GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》測定［12］，取樣量為1.00 g；灰分含量的測定按照國標GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》測定［13］，取樣量為1.00 g。

2.3 靈芝孢子粉活性物質(zhì)溶出量測定

2.3.1 粗多糖溶出量測定

粗多糖溶出量的測定參照樊偉偉等［14］的方法。

（1）標準曲線繪制。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 0.1 mg/mL葡萄糖溶液，分別用蒸餾水補足到1.0 mL。加入1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，靜置10 min后使用渦旋振蕩器混勻，30 ℃水浴保溫20 min。在490 nm處比色，測定其吸光值。繪制標準曲線，得到葡萄糖質(zhì)量與吸光值的回歸方程為：

式中 y2——葡萄糖質(zhì)量，mg；

x2——葡萄糖對應的吸光值。

（2）粗多糖待測液制備。稱取破壁前后靈芝孢子粉0.25 g于15 mL離心管，加入2.5 mL蒸餾水，并緩慢注入10 mL無水乙醇，使用渦旋振蕩器充分混勻后，超聲提取30 min，4000 r/min條件下離心10 min，棄去上清。將不溶物中加入10 mL 80%乙醇進行洗滌，離心后棄去上清液，使用25 mL蒸餾水將沉淀轉(zhuǎn)入50 mL刻度試管，沸水浴提取2 h。待冷卻至室溫后，過濾，將濾液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶。將殘渣洗滌3次，合并洗滌液，加水定容至50 mL。測定時取1 mL待測液，后續(xù)步驟同標準曲線。樣品中的粗多糖溶出量以（g/100g）表示，結(jié)果下式計算。

式中 m1—— 從標準曲線上查得樣品測定液中含葡萄糖量，μg；

V1——樣品定容體積，mL；

V2—— 比色測定時所移取樣品測定液的體積，mL；

m2——樣品質(zhì)量，g；

0.9 ——葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

2.3.2 總?cè)迫艹隽康臏y定

總?cè)迫艹隽康臏y定參照徐雪峰等［15］的方法。

（1）標準曲線繪制。吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 0.1 mg/mL熊果酸對照品溶液，分別于100 ℃水浴蒸干，加入4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，65 ℃水浴加熱45 min，轉(zhuǎn)入冰浴后加入5 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫。15 min后于548 nm處比色，測定其吸光值。繪制標準曲線，得到熊果酸質(zhì)量與吸光值的回歸方程為：

式中 y3——熊果酸質(zhì)量，mg；

x3——熊果酸對應的吸光值。

（2）總?cè)拼郎y液制備。準確稱取破壁前后靈芝孢子粉0.50 g，加入15 mL乙酸乙酯溶解，超聲提取30 min后過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶。測定時取1 mL待測液，水浴蒸干后加試劑同標準曲線。樣品中的總?cè)迫艹隽恳裕╣/100g）表示，結(jié)果下式計算。

式中 m1—— 從標準曲線上查得樣品測定液中含熊果酸量，μg；

V1——樣品定容體積，mL；

V2—— 比色測定時所移取樣品測定液的體積，mL；

m2——樣品質(zhì)量，g。

2.4 靈芝孢子粉水、醇提取物抗氧化性的測定

取1.0 g靈芝孢子粉，按1：10體積分別加入10 mL的蒸餾水和70%乙醇，60 ℃超聲提取30 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液分別進行水、醇提取物抗氧化性測定［16-17］。

2.4.1 清除DPPH·能力的測定

分別取靈芝孢子粉水、醇提取物0.2 mL，加入3.8 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，振蕩混勻，避光靜置30 min，于517 nm波長處測定吸光值A1。同時，用無水乙醇代替DPPH溶液，測得吸光值A2，并測定3.8 mL DPPH溶液和0.2 mL 70%乙醇的吸光值A0。靈芝孢子粉水、醇提取物DPPH·清除率以（%）表示，結(jié)果按下式計算。

2.4.2 清除ABTS能力的測定

分別取靈芝孢子粉水、醇提取物0.1 mL，加入3.9 mL ABTS（于734 nm測得吸光值為0.7），振蕩混勻，避光靜置15 min，于734 nm波長處測定吸光值A'0。靈芝孢子粉水、醇提取物ABTS·清除率以（%）表示，結(jié)果按下式計算。

2.4.3 還原能力的測定

吸取0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mL 1 mmol/mL FeSO4標準溶液，加蒸餾水補至0.2 mL，加4 mL TPTZ，振蕩混勻，37 ℃水浴反應10 min，于593 nm波長處測定吸光值A。繪制標準曲線，得到FeSO4濃度與吸光值的回歸方程為：

式中 y4——FeSO4濃度，μmoL/g；

x4——FeSO4對應的吸光值。

分別取靈芝孢子粉水、醇提取物0.2 mL，加入4 mL TPTZ，振蕩混勻，37 ℃水浴反應10 min，于593 nm波長處測定吸光值A'。從FeSO4標準曲線查得樣品相應的FeSO4濃度（μmol/mL），根據(jù)取樣量將單位轉(zhuǎn)化為μmol/g得FRAP值。

3 結(jié)果與分析

3.1 靈芝孢子粉破壁率測定分析

采用球磨儀對靈芝孢子粉進行破壁處理，于400倍顯微鏡下觀察并計數(shù)，計算得靈芝孢子粉破壁率為91.66%。顯微鏡下可看到大部分靈芝孢子粉孢壁破裂，視野下分布大小不均一的碎片。

3.2 靈芝孢子粉基本營養(yǎng)成分分析

靈芝孢子粉破壁前后基本營養(yǎng)成分測定結(jié)果見表1。破壁前后靈芝孢子粉水分均為0.03%，灰分分別為1.84%和1.99%，水分和灰分在破壁前后均無顯著變化。破壁前后靈芝孢子粉粗蛋白溶出量分別為5.57%和7.46%，破壁后溶出量提高了33.90%。敖宏［18］的研究表明，靈芝蛋白粗提物清除活性隨著靈芝蛋白濃度的增加而逐漸增強。破壁后靈芝孢子粉中的粗蛋白溶出量增加，其具有的抗氧化作用也隨之增加。

表1 靈芝孢子粉破壁前后基本營養(yǎng)成分測定結(jié)果 %

靈芝孢子粉粗脂肪溶出量是評價靈芝孢子粉質(zhì)量較為重要的一個指標，粗脂肪溶出量的高低代表著靈芝孢子粉質(zhì)量的好壞。由表1可知：破壁前后靈芝孢子粉粗脂肪溶出量分別為7.55%和22.17%，破壁后溶出量提高了2.94倍。與其他基本營養(yǎng)成分相比，破壁靈芝孢子粉粗脂肪溶出量增加最為顯著。破壁靈芝孢子粉粗脂肪溶出量顯著提高的緣由是孢子內(nèi)部甘油三酯被大量釋放，可增加人體吸收孢子粉營養(yǎng)成分的可能性［19］。

3.3 靈芝孢子粉活性物質(zhì)測定結(jié)果分析

靈芝孢子粉破壁前后活性物質(zhì)溶出量見表2。破壁前后靈芝孢子粉粗多糖溶出量分別為0.88，1.24 g/100g，破壁后提高了40.90%，提高了人體對粗多糖吸收利用的可能性。趙曉燕等［20］的試驗結(jié)果表明，99%破壁率靈芝孢子粉較未破壁靈芝孢子粉粗多糖溶出量有所提高。曹龍奎等［21］通過激光粒度測定儀測得經(jīng)行星球磨儀破壁的玉米花粉顆粒直徑從原來的80～100 μm降至8 μm以下，破壁后玉米花粉中的活性成分進一步釋放。這與本試驗中采用球磨儀對靈芝孢子粉進行破壁處理的效果一致。

表2 靈芝孢子粉破壁前后活性物質(zhì)溶出量測定結(jié)果

破壁前后靈芝孢子粉總?cè)迫艹隽糠謩e為1.63，2.53 g/100g，破壁后提高了55.21 %。趙曉燕等［20］采用超微粉碎處理得到99%破壁率的靈芝孢子粉，其總?cè)迫艹隽刻岣吡?7%。靈芝孢子粉受到球磨儀中的剪切和壓縮聯(lián)合外力作用致孢壁破裂，孢內(nèi)靈芝孢子粉總?cè)迫艹隽刻岣摺?/p>

3.4 靈芝孢子粉抗氧化性測定結(jié)果分析

靈芝孢子粉破壁前后DPPH·清除率試驗結(jié)果如圖1（a）所示。破壁前靈芝孢子粉水提取物的DPPH·清除率僅為13.74%，但在破壁后為68.52%，提高了4.99倍；破壁前醇提取物的DPPH·清除率為42.33%，破壁后為67.33%，提高了59.04%。破壁前靈芝孢子粉醇提取物比水提取物的DPPH·清除率提高了3.08倍，但在破壁后水、醇提取物對DPPH·的清除能力分別為68.52%、67.33%，表明破壁前靈芝孢子粉水、醇提取物對DPPH·的清除能力相差較大，而在破壁后對DPPH·的清除能力相對持平。這與靈芝孢子粉粗多糖和總?cè)频娜艹隽肯嚓P(guān)［22］。靈芝孢子粉水提取物抗氧化能力在一定程度上可反映粗多糖抗氧化能力，而醇提取物抗氧化能力在一定程度上可反映總?cè)频目寡趸芰ΑＮ雌票陟`芝孢子粉中總?cè)聘哂诖侄嗵?，使得未破壁靈芝孢子粉醇提取物比水提取物的DPPH·清除率高。

靈芝孢子粉破壁前后ABTS·清除率試驗結(jié)果如圖1（b）所示。破壁前靈芝孢子粉水提取物的ABTS·清除率為27.52%，但在破壁后為33.58%，提高了22.05%；破壁前醇提取物的ABTS·清除率為31.57%，破壁后為35.59%，提高了12.76%。破壁前靈芝孢子粉醇提取物比水提取物的ABTS·清除率提高14.72%；破壁后靈芝孢子粉的水、醇提取物對ABTS·的清除能力33.58%、35.59%，表明破壁后靈芝孢子粉水、醇提取物的對ABTS·清除能力相對持平。

靈芝孢子粉破壁前后還原能力試驗結(jié)果如圖1（c）所示。未破壁靈芝孢子粉水提取物的FRAP值為11 955 μmol/g，破壁后為27 041 μmol/g，提高了2.26倍；未破壁靈芝孢子粉醇提取物的FRAP值為23 348 μmol/g，破壁后為31 938 μmol/g，提高了36.79%。破壁前靈芝孢子粉醇提取物比水提取物的還原能力提高了1.95倍，而在破壁后醇提取物比水提取物的還原能力僅提高了18.11%，表明破壁前靈芝孢子粉水、醇提取物的還原能力相差較大，而在破壁后還原能力相差較小。靈芝三萜和多糖抗氧化性研究表明，抗氧化能力與活性物質(zhì)溶出量成正相關(guān)［23］。破壁后靈芝孢子粉多糖和總?cè)迫艹隽糠謩e提高了40.90%和55.21%，抗氧化能力提高。

破壁后靈芝孢子粉水、醇提取物對DPPH·、ABTS·清除率及還原能力大小順序均為DPPH·＞FRAP＞ABTS·；破壁前靈芝孢子粉醇提取物對DPPH·、ABTS·清除率及還原能力大小順序為DPPH·＞FRAP＞ABTS·，破壁后靈芝孢子粉水、醇提取物對三者的抗氧化能力相差較小。

4 結(jié)語

破壁前后靈芝孢子粉的水分和灰分變化不顯著，粗蛋白和粗脂肪溶出量明顯增加，尤其是粗脂肪溶出量比未破壁靈芝孢子粉提高了2.94倍；破壁前后靈芝孢子粉粗多糖、總?cè)频幕钚晕镔|(zhì)溶出量均顯著提高；破壁后靈芝孢子粉的水、醇提取物的抗氧化能力均優(yōu)于未破壁靈芝孢子粉。