微生物法制備松仁肽-鋅螯合物及其抗氧化功能的研究

孫家佳 張 智 楊可心 魏 罡 宋希明

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1，哈爾濱 150040) (烏蘭察布市林業(yè)和草原局2，烏蘭察布 012000)

我國(guó)使用松子已有三千多年的歷史，宋代人們把松子視為延年益壽的“長(zhǎng)生果”。由于松仁是美味食物，又是食療佳品，備受歷代醫(yī)學(xué)家、營(yíng)養(yǎng)學(xué)家推崇。松仁中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等，尤其是人體所必需氨基酸含量較普通植物的高[1]。張智等[2]對(duì)于松仁蛋白的利用提出了微生物發(fā)酵生產(chǎn)松仁肽，改善了松仁肽的口味[3]的同時(shí)達(dá)到了蛋白吸收的營(yíng)養(yǎng)預(yù)期。松仁肽具有良好的功能性及生物活性[4, 5]，對(duì)人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，如促進(jìn)免疫、降血壓血脂、抗氧化[6]等作用，是當(dāng)前國(guó)際藥學(xué)和食品界熱門(mén)的物質(zhì)和極具發(fā)展前景的功能性因子[7]。

鋅存在于眾多的酶系中，如碳酸酐酶、呼吸酶、乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、DNA和RNA聚合酶等中，是核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物的合成和維生素A利用的必需物質(zhì)。具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，改善味覺(jué)的作用。鋅是人體必不可少的微量元素之一[8]，在人體生長(zhǎng)發(fā)育[9]、生殖遺傳等起到至關(guān)重要的作用[10]。

多肽-鋅螯合物既具有補(bǔ)鋅作用[10, 11]，同時(shí)也具有一些特殊的生物活性[12]。張亞麗[13]利用中性蛋白酶水解脫脂豆粕后形成的多肽與微量元素鋅制備多肽螯合鋅，添加多肽螯合鋅的豬油和魚(yú)油的過(guò)氧化值均低于對(duì)照組，說(shuō)明其是具有抗氧化作用的；將多肽-鋅螯合物喂食小鼠，發(fā)現(xiàn)多肽-鋅螯合物具有一定的生物吸收利用率，可以作為食品鋅強(qiáng)化劑。近年來(lái)，對(duì)活性肽的研究尤為突出，并以其為原料，開(kāi)發(fā)易于身體吸收利用[14]、生理活性強(qiáng)的新型補(bǔ)鋅劑，已成為熱點(diǎn)研究問(wèn)題[15]。基于螯合物的利用價(jià)值較高，并且現(xiàn)有研究?jī)H僅局限化學(xué)方法進(jìn)行螯合，本文主要介紹微生物法螯合，微生物通過(guò)自身的生理功能分解蛋白的同時(shí)與鋅離子結(jié)合，形成螯合物，并對(duì)該方法及其抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要原料與試劑

松仁粕，市售；蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、Fe Cl3、H2O2、水楊酸、Fe SO4、98%硫酸等藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。松仁肽(微生物法制備)。

1.2 儀器與設(shè)備

756PC紫外分光光度計(jì)；HPG-310培養(yǎng)箱；SW-CJ-IFD超凈臺(tái)；離心機(jī)LD4-2A等。

1.3 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45，來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、牛肉膏1 g、蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉20 g，加熱溶解于1 L水中；種子培養(yǎng)基: 葡萄糖20 g、牛肉膏1 g、蛋白胨5 g、氯化鈉5 g，溶于1 L的水中；發(fā)酵培養(yǎng)基：一定量的松仁粉和硫酸鋅溶于水中。

2 實(shí)驗(yàn)方法

松仁粕預(yù)處理→發(fā)酵加鋅培養(yǎng)基配置→滅菌→接種→發(fā)酵→離心→取上層清液→透析→濃縮→冷凍干燥→粗制松仁肽-鋅螯合物

微生物法松仁多肽制備的工藝流程：松仁粕預(yù)處理→發(fā)酵培養(yǎng)基配置→滅菌→接種→發(fā)酵→離心→取上層清液→濃縮→冷凍干燥→粗制松仁肽

2.1 微生物螯合的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 螯合單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中松仁粕的量為12%，以螯合率為指標(biāo)，微生物螯合當(dāng)中硫酸鋅的添加量、螯合溫度、螯合時(shí)間和pH等4個(gè)因素5個(gè)水平來(lái)對(duì)微生物法螯合松仁肽與鋅的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.2 微生物法螯合條件單因素實(shí)驗(yàn)

生物螯合硫酸鋅添加量的影響：硫酸鋅的添加量為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g等5個(gè)因素水平，微生物螯合時(shí)間為50 h溫度為35 ℃，以螯合率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最佳添加量。

微生物螯合pH的影響：運(yùn)用上述實(shí)驗(yàn)得出最佳結(jié)果進(jìn)行下一步，pH設(shè)計(jì)的值為5、6、7、8、9等5個(gè)因素水平，以螯合時(shí)間為50 h溫度為35 ℃，螯合率為指標(biāo)，尋找出最優(yōu)的pH值進(jìn)行螯合。

微生物螯合時(shí)間的影響：在以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果下，設(shè)計(jì)的時(shí)間為20、30、40、50、60 h等。硫酸鋅添加量和pH值采用實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果，溫度為35 ℃的條件下進(jìn)行微生物螯合。指標(biāo)為螯合率。

微生物螯合溫度的影響：在以上三個(gè)因素最優(yōu)的條件下，溫度設(shè)計(jì)為33、35、37、39、41 ℃等5個(gè)因素水平。以螯合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出最佳溫度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

按照中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以微生物螯合的硫酸鋅添加量、pH、時(shí)間、溫度等4個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素3個(gè)水平，并以螯合率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

表1 因素水平編碼表

2.3 測(cè)定的方法

2.3.1 發(fā)酵液中肽含量的測(cè)定

對(duì)于肽的計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)以氮的質(zhì)量來(lái)計(jì)算。

氨基態(tài)氮的測(cè)定采用甲醛快速滴定法，氨基態(tài)的氮記作A1。

蛋白分解的可溶性氮(TCA)采用國(guó)標(biāo)方法中的凱氏定氮測(cè)定法(GB/T 5009.5—1985)，測(cè)之前用三氯乙酸處理，測(cè)得的氮記作Nt。

N(肽的質(zhì)量以氮計(jì))=Nt-A1

式中：Nt為發(fā)酵液中的可溶性氮(TCA)/g;

A1為發(fā)酵液中的氨基態(tài)的氮/g。

2.3.2 螯合率的測(cè)定

吸取處理后的發(fā)酵液5 mL裝入透析袋中，以去離子水作為透析液，透析10 h后測(cè)透析液中未被螯合上的鋅離子。鋅離子的測(cè)定采用國(guó)標(biāo)食品中鋅的測(cè)定方法中的二硫腙比色法(GB 5009.14—2017)，按標(biāo)準(zhǔn)繪制鋅離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此法測(cè)得的鋅離子量記作M0；加入到發(fā)酵培養(yǎng)基的鋅離子的量記作M1。

式中：M0為未被螯合上的鋅離子的質(zhì)量/μg；M1為加入螯合培養(yǎng)基中鋅離子的質(zhì)量/mg。

2.3.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

取DPPH 3.5 mg，用無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶，用無(wú)水乙醇定容至刻度。取2 mL至100 mL的容量瓶中，搖勻得濃度為0.017 8 mmol/L DPPH儲(chǔ)備液備用。用乙醇將松仁肽-鋅的螯合物稀釋一定濃度，待測(cè)。在10 mL比色管中一次加入4 mL DPPH和螯合物的稀釋液，加入乙醇至刻度，混均勻立即在517 nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光值[16]記為Ai。將待測(cè)液在室溫避光的條件下保存30 min后測(cè)吸光值。記為Aj。對(duì)照試驗(yàn)為只加DPPH的乙醇溶液，測(cè)吸光值為Ac，按下式計(jì)算自由基清除率(K)[17]。

2.3.4 還原力的測(cè)定

取1 mL三種不同質(zhì)量濃度的3種待測(cè)樣品溶液，分別與 pH為6.6，濃度為0.2 mol/L，2.5 mL的磷酸鈉緩沖液和2.5 mL的鐵氰化鉀混合，在50 ℃，保溫30 min，后迅速冷卻，再加入2.5 mL三氯乙酸后離心3 000 r/min，10 min后取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液，混合均勻[18]。反應(yīng)10 min，后在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，比較3種被測(cè)樣品的還原能力，吸光度越大說(shuō)明還原能力越強(qiáng)[19]。

2.3.5 羥自由基的測(cè)定

H2O2與亞鐵離子生成·OH，·OH自由基具有較高的反應(yīng)活性，因?yàn)榇婊顣r(shí)間較短，加入水楊酸，會(huì)與·OH 自由基反應(yīng)生產(chǎn)紫色絡(luò)合物，該有色絡(luò)合物在510 nm出有較大的吸收波長(zhǎng)，吸光度與·OH 自由基的量成正比[20, 21]。反應(yīng)體系中含有9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液，9 mmol/L硫酸亞，8.8 mmol/L H2O2。比色管中依次加入硫酸亞鐵，水楊酸、去離子水，最后加入H2O2，搖勻，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水歸零，在510 nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[22, 23]。

式中：A0空白對(duì)照組的吸光度；AX加入樣品后的吸光度；AX0不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 微生物螯合的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)表明硫酸鋅的添加量對(duì)螯合率的影響較大，由圖1可知，當(dāng)硫酸鋅的添加量為0.6 g時(shí)的螯合率最高，這時(shí)的螯合物的結(jié)合狀態(tài)最好，產(chǎn)生的螯合物量較多，綜合的來(lái)看，發(fā)酵法螯合的硫酸鋅添量為0.6 g最為合適；在pH為7 的條件下螯合率最高，在微生物學(xué)當(dāng)中pH 對(duì)微生物來(lái)說(shuō)具有較大的影響，在適宜的pH值下微生物能夠很好地生長(zhǎng)，通過(guò)微生物生理活性的作用下更能促進(jìn)蛋白分解為小分子肽，并使多肽與鋅離子更好的結(jié)合。所以綜合分析，在微生物法螯合時(shí)應(yīng)選擇pH 7的條件；運(yùn)用微生物法螯合，要選擇合適的時(shí)間，使微生物處于最佳的菌齡，才能更好的發(fā)揮微生物的作用，在50 h時(shí)螯合率最高，想得到最佳的發(fā)酵工藝，使螯合率和螯合物的活性最強(qiáng)，所以選擇發(fā)酵螯合時(shí)間為50 h；溫度對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和鋅離子的螯合是有著重要的影響，所以對(duì)于溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的增加螯合率是呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，隨著溫度的增加將會(huì)影響微生物的一些生理活性，從而導(dǎo)致微生物的作用減少，影響了螯合率以及螯合物的生物活性，所以綜合分析在運(yùn)用微生物法螯合時(shí)溫度應(yīng)選擇最為適宜的，該實(shí)驗(yàn)則選擇溫度為37 ℃。

圖1 不同因素對(duì)螯合率的影響

3.2 螯合條件響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)表1，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，來(lái)對(duì)松仁肽與鋅螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析

續(xù)表2

3.2.1 螯合率分析結(jié)果

采用 Design-Expert.8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,以螯合率為指標(biāo)，得到回歸方程如下:Y1=0.938 2-0.006 4A+0.011B+0.019C-0.002 6D-0.038AC-0.039AD-0.035BC-0.022BD+0.027CD-0.071A2-0.068B2-0.072C2-0.033D2

由表3可知，模型中P<0.000 1，R2=0.982 1，表明此模型極其顯著。失擬項(xiàng)P=0.845 8>0.05，影響不顯著，說(shuō)明結(jié)果可靠。由回歸方程的顯著性檢驗(yàn)可知，模型中C、AC、BC、CD、B2、C2對(duì)螯合率的影響極顯著，B、AD、BD對(duì)螯合率的影響顯著，其他因子影響不顯著。各因素對(duì)螯合率影響的大小依次為:C>B>A>D。

表3 螯合率回歸模型的方差分析

注：“*”在 0.01 水平顯著；“**”在 0.001 水平顯著。

硫酸鋅添加量、pH、時(shí)間和溫度中任意2個(gè)因素為零水平時(shí)，剩下2個(gè)因素均可對(duì)螯合率產(chǎn)生不同程度的影響。通過(guò)面陡峭程度判斷因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性。結(jié)果顯示: pH和溫度對(duì)螯合率的影響顯著，隨著這2個(gè)因素值的升高，螯合率均先上升后下降，其他兩個(gè)因素相比較沒(méi)有那么顯著。這與表3中的方差分析的結(jié)果一致。

3.2.2 最佳工藝參數(shù)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)方程計(jì)算可得最佳工藝方案為：硫酸鋅的添加量為0.6 g，螯合時(shí)間為50.36 h，溫度為38.46 ℃，pH為7.41。螯合率理論值為91.35%。根據(jù)實(shí)際情況將實(shí)驗(yàn)方案調(diào)整為，硫酸鋅的添加量為0.6 g，時(shí)間為50 h，溫度為38 ℃，pH值為7，在此條件下，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，最終測(cè)得螯合率為90.60%、92.48%。與理論值相差不大，所以經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件是可靠的。

3.3 松仁肽-鋅螯合物的體外抗氧化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

微生物發(fā)酵的松仁肽與松仁肽-鋅螯合物抗氧化能力的對(duì)比，并以VC作為對(duì)照。

3.3.1 DPPH自由基的測(cè)定

由圖2可知，松仁肽和松仁肽-鋅螯合物在不同的濃度下均表現(xiàn)出來(lái)很強(qiáng)的DPPH自由基的清除能力，隨濃度的增加，DPPH 自由基清除率也增加，VC對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為2.123 mg/mL，松仁肽對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為1.564 3 mg/mL，松仁肽-鋅的螯合物對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為3.841 mg/mL，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，10mg/mL樣品的清除作用最強(qiáng)，松仁肽的自由基清除率為84.06%，松仁肽-鋅螯合物的自由基清除率為90.31%，VC 的自由基清除率為94.36%。三者質(zhì)量濃度均與DPPH自由基清除率有顯著的正相關(guān)性(松仁肽、松仁肽-鋅螯合物、VC的R2分別為0.941 01、0.922 85、0.918 8)。螯合物的DPPH 自由基清除率均

圖2 不同濃度的螯合物和松仁肽對(duì)DPPH自由基的清除能力

高于單純肽，DPPH自由基清除能力是基于DPPH自由基接受抗氧化劑提供的氫原子使奇數(shù)電子的氮原子減少?gòu)亩痼w系中顏色的降低，抗氧化劑清除DPPH自由基效果主要依賴于其供氫的能力[24]，由此可推測(cè)松仁肽-鋅螯合物在清除自由等一些連鎖反應(yīng)具有一定的功能，且松仁肽-鋅的螯合物要高于松仁肽，但是兩者均小于陽(yáng)性對(duì)照組VC的清除率。

3.3.2 還原力的測(cè)定

由圖3可得，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，松仁肽和松仁肽-鋅螯合物的吸光度不斷升高，還原能力不斷增強(qiáng)，說(shuō)明樣品質(zhì)量濃度越大，其還原作用越強(qiáng)，兩者存在著明顯的劑量依賴關(guān)系。松仁肽和松仁肽-鋅螯合物的還原能力與其質(zhì)量濃度之間基本上呈直線性關(guān)系，陽(yáng)性對(duì)照VC的還原能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，也存在劑量依賴關(guān)系，并且也是呈直線性關(guān)系。三者質(zhì)量濃度均與還原能力有顯著的正相關(guān)性(松仁肽、松仁肽-鋅螯合物、VC的R2分別為0.965 99、0.949 18、0.980 12)，但松仁肽的還原能力始終低于同質(zhì)量濃度的松仁肽-鋅螯合物，二者始終低于同質(zhì)量濃度的VC。研究表明[25]，多肽類物質(zhì)的抗氧化性質(zhì)與還原能力之間具有相關(guān)性，所以還原能力可以作為一種衡量抗氧化能力的指標(biāo)。因此松仁肽和松仁肽-鋅的螯合物就有較強(qiáng)的還原能力同時(shí)也具有抗氧化性。且松仁肽-鋅螯合物的還原能力更強(qiáng)。

圖3 不同濃度的螯合物和松仁肽的還原能力

3.3.3 羥自由基的測(cè)定

由圖4可知，松仁肽和松仁肽-鋅螯合物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除·OH活性。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，但二者清除率均低于陽(yáng)性對(duì)照VC。通過(guò)清除率-質(zhì)量濃度回歸曲線可知VC對(duì)·OH的IC50為0.513 mg/mL，松仁肽-鋅螯合物對(duì)·OH的IC50為1.346 mg/mL，松仁肽對(duì)·OH的IC50為1.725 mg/mL，6 mg/mL樣品的清除作用最強(qiáng)，松仁肽清除率達(dá)80.56%，松仁肽-鋅螯合物清除率達(dá)88.96%，在相同質(zhì)量濃度下VC對(duì)·OH的清除率為92.53%。三者質(zhì)量濃度均與·OH清除率有顯著的正相關(guān)性(松仁肽、松仁肽-鋅螯合物、VC的R2分別為0.988 75、0.976 48、0.993 27)?！H被認(rèn)為是引發(fā)機(jī)體內(nèi)組織細(xì)胞病變，導(dǎo)致疾病與加速衰老最直接的自由基[26]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，松仁肽-鋅螯合物具有較強(qiáng)的·OH清除率，因此推測(cè)其具有減少疾病的發(fā)生和延緩衰老的作用，且松仁肽-鋅螯合物的清除能力強(qiáng)于松仁肽，但兩者均弱于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖4 不同濃度的螯合物和松仁肽對(duì)·OH的清除能力

4 討論

早在十九世紀(jì)六十年代中期，研究者就發(fā)現(xiàn)肽具有促進(jìn)鋅吸收的作用。大量的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肽能與鋅離子發(fā)生反應(yīng)，生成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、可溶的肽鋅螯合物。這種螯合物能夠使鋅元素不受胃腸道中植酸等各類物質(zhì)的影響，并能以肽的吸收模式進(jìn)入體內(nèi)，給人體補(bǔ)鋅提供了新的途徑[27]。本實(shí)驗(yàn)研究了微生物法對(duì)松仁肽-鋅進(jìn)行螯合，運(yùn)用枯草芽孢桿菌將松仁蛋白分解為小分子肽的同時(shí)與鋅離子螯合，得出最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)為：硫酸鋅的添加量為0.6 g，螯合時(shí)間為50.36 h，溫度為38.46 ℃，pH值為7.41。影響發(fā)酵螯合反應(yīng)的因素水平溫度最大，其次是pH。優(yōu)化得到螯合率為90.60%，與理論值相差不大，工藝參數(shù)可行。通過(guò)對(duì)松仁肽和松仁肽-鋅螯合物抗氧化的研究，螯合物的還原能力高于松仁肽且還原能力隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)。二者均可有效的清除DPPH自由基和·OH，螯合物的清除力強(qiáng)于松仁肽。鋅離子與肽形成配合物后呈現(xiàn)出多樣的生物功能活性，如抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等生物活性，綜合以上結(jié)論，松仁肽與鋅螯合后得到了生物活性高而且毒性低的有機(jī)鋅化合物，且能很好的為機(jī)體補(bǔ)鋅，松仁肽螯合后的松仁肽-鋅螯合物的抗氧化能力強(qiáng)于螯合前的松仁肽。同時(shí)松仁肽的抗氧化活性對(duì)于開(kāi)發(fā)松仁肽-鋅螯合物功能性食品提供了方向和理論基礎(chǔ)，具有應(yīng)用指導(dǎo)意義，但具體的抗氧化功能機(jī)理需進(jìn)一步研究，微生物法制備松仁肽-鋅螯合物的抗氧化功能性需要做體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。