體外模擬消化對(duì)四種雜糧中酚類物質(zhì)及其降脂活性的影響

姚軼俊 李枝芳 王立峰 鞠興榮

(江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122) (南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心2，南京 210023)

雜糧是指除稻米、小麥、玉米等主糧以外的谷物，主要包括高粱、燕麥、蕎麥、薏米、青稞、紅豆、黑豆、蕓豆、豌豆等。雜糧一般種植在相對(duì)特殊的地區(qū)，種植面積小、產(chǎn)量較低，但是含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[1]。近年來研究表明，雜糧中富含植物化學(xué)成分，如酚酸、黃酮、花青素、植物甾醇等，他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了比傳統(tǒng)主糧及水果更高的生理活性[2]。相關(guān)流行病學(xué)研究指出，雜糧類食品的長(zhǎng)期攝入可以有效降低心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、結(jié)腸癌和腦卒中等慢性病的發(fā)病率，并且有助于控制體重[3]。同時(shí)，我國(guó)雜糧產(chǎn)量約占世界雜糧總產(chǎn)量的17.1%，占國(guó)內(nèi)糧食總產(chǎn)量的10.0%。我國(guó)居民膳食指南建議每日粗雜糧的攝入量為50～100 g，但調(diào)查結(jié)果顯示，成年人每日粗雜糧的攝入量?jī)H為14 g，不到推薦攝入量的1/3，且食用種類單一[4]。因此，雜糧及相關(guān)食品在我國(guó)具有十分廣泛的研究及利用前景。

隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)所發(fā)生的變化，目前肥胖與超重在世界范圍內(nèi)日益增加，與之直接相關(guān)的疾病發(fā)生率也不斷上升。其特點(diǎn)是死亡率高、復(fù)發(fā)率高，一旦形成較難治愈[5]。奧利司他是目前市場(chǎng)上治療肥胖最為暢銷的藥物之一，但是有較多的副作用，如油性斑點(diǎn)、便秘、腹瀉等[6]。研究表明多酚類化合物能夠阻斷脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，通過抑制血小板凝集和誘導(dǎo)血管舒張那個(gè)等改善血液的流變性，從而有效緩解心腦血管疾病的發(fā)生[7，8]。雜糧中除了碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外，還富含具有生物活性功能的酚類化合物，包括酚酸、香豆素、單寧酸、黃酮類化合物、烷基間苯二酚等[9]。已有研究證明，糙米、玉米、燕麥等谷物中結(jié)合多酚占50%以上，而薏米、蕎麥、青稞等谷物中則以游離多酚為主[10，11]。因此雜糧類食品的降脂功能也越來越得到人們的關(guān)注。

近年來，對(duì)雜糧降脂功能的研究多建立在在體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上。然而食品本身的活性成分及其功能并不能完全等同于其對(duì)人體的功能，諸多因素都會(huì)影響活性成分在人體內(nèi)的利用率，如該物質(zhì)在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性、從大分子組分中釋放出來的穩(wěn)定性、與其他食品組分的交互影響以及通過小腸細(xì)胞的難易程度等[12]。因此，研究消化過程對(duì)活性成分的影響對(duì)于功能性的雜糧食品來說具有重要的意義。Glahn等[13]研究發(fā)現(xiàn)，利用體外消化模型測(cè)定鐵離子的生物利用率與人體實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)基本一致。體外模擬胃腸道消化作為一種方便、快捷、低成本的方式，可以有效地反映出食物在人體內(nèi)消化吸收過程中的變化，已被廣泛地應(yīng)用于食品活性組分在人體內(nèi)的消化吸收情況以及加工工藝對(duì)食品組分生物利用率的相關(guān)研究中[14，15]。同時(shí)由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在周期長(zhǎng)、個(gè)體差異大、影響因素眾多和實(shí)驗(yàn)條件不易控制等缺點(diǎn)，因此培養(yǎng)周期短、成本低、最接近人體反應(yīng)的人體肝癌細(xì)胞HepG2被廣泛應(yīng)用于食品功能成分的研究[16，17]。因此，研究體外模擬消化對(duì)雜糧中酚類物質(zhì)的影響及其降脂活性具有重要的意義。

因此，本研究以我國(guó)常見的4種雜糧(薏米、蕎麥、青稞、紅豆)為原料，構(gòu)建體外消化模型研究四種雜糧在消化過程中酚類物質(zhì)含量的變化；并基于HepG2細(xì)胞構(gòu)建高脂模型，對(duì)上述四種雜糧消化液中多酚提取物進(jìn)行降脂活性的評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制及擴(kuò)充現(xiàn)代人的健康膳食選擇、預(yù)防慢性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

薏米(遼寧5號(hào)Coix lachryma-jobi L.)、蕎麥(大三棱Fagopyrum esculentum Moench.)、青稞(北青3號(hào)Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook.f.)、紅豆(天津紅Abrus precatorius L.)，當(dāng)季采收后在陰涼避光條件下儲(chǔ)藏，并在3個(gè)月內(nèi)使用；乙醇、正己烷、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶；豬膽汁、熒光素鈉鹽、水溶性維生素E、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈣等均為化學(xué)純；乙腈、三氟乙酸、噻唑藍(lán) ( MTT )、二甲基亞砜 ( DMSO) 等均為分析純；人體肝癌細(xì)胞株HepG2、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、甘油三酯(TG)測(cè)試盒(A110-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)試盒(A111-1)。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500快速自動(dòng)高壓滅菌鍋；FW100高速粉碎機(jī)；Beckman Coulter J6高速冷凍離心機(jī)； pHS-3C型精密數(shù)顯pH計(jì)；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器；ALpHA2-4型真空冷凍干燥機(jī)；SpectraMax M2e酶標(biāo)儀；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 樣品熟化

分別取4種雜糧(薏米、蕎麥、青稞、紅豆)各20 g，按原料與水1∶9(質(zhì)量比)加蒸餾水于器皿中，用電磁爐以1 800 W功率加熱，待水開始沸騰后再分別蒸煮25 min， 并在蒸煮后關(guān)掉電磁爐燜制10 min。冷卻至室溫后用料理機(jī)勻漿3 min。

1.3.2 模擬體外消化

將熟化后的4種雜糧均漿各200 mL裝在消化瓶中，并放置于37 ℃、100 r/min的恒溫水浴搖床中，加入含有10.00 mg唾液α-淀粉酶的CaCl2溶液15 mL(1 mmol/L、pH 7.0)消化反應(yīng)30 min，模擬口腔消化階段；然后，用6 mol/L HCl將其pH調(diào)節(jié)至2.00，加入溶解有0.25 g胃蛋白酶的HCl溶液(0.1 mol/L、5 mL)，消化120 min，模擬胃消化階段；最后用1 mol/L的NaHCO3將pH調(diào)節(jié)至7.0，隨后加入溶解有0.25 g胰酶和0.70 g膽酸的NaHCO3溶液(0.5 mol/L、10 mL)，消化180 min，模擬小腸消化階段[18，19]。取上述各階段消化液5 mL，10 000 r/min離心10 min取上清液，再分別按照體積比1∶1加入80%的丙酮除去剩余的蛋白和多糖，10 000 r/min離心10 min取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并凍干后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 活性物質(zhì)測(cè)定

總酚(TP)測(cè)定：1 mg樣品溶于1 mL 80%的丙酮溶液，取100 μL樣品溶液(或沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液)與400 μL去離子水混合，接著與0.1 mL的福林酚溶液混合，在避光條件下放置5 min，和1 mL 7%的碳酸鈉溶液和0.8 mL的去離子水混合，在室溫下避光反應(yīng)90 min，將200 μL最終反應(yīng)溶液添加到96孔板中，使用酶標(biāo)儀在760 nm處測(cè)定吸光度。沒食子酸在該實(shí)驗(yàn)中作為標(biāo)準(zhǔn)品，最終結(jié)果表示為沒食子酸/樣品(mg/g)[20]。

總黃酮(TPC)測(cè)定：稱取試樣0.3 g，置于25 mL試管，用80%丙酮溶解置刻度，混勻，超聲提取40 min， 冷卻至室溫，定容，搖勻，離心。取離心后的上清液1 mL于蒸發(fā)皿中，加2 g聚酰胺粉吸附，于水浴鍋上蒸干揮去乙醇，轉(zhuǎn)入層析柱，用20 mL乙醚分多次洗脫除雜，后用甲醇洗脫黃酮，定容至25 mL，于360 nm測(cè)定其吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品采用校正曲線法計(jì)算其總黃酮含量[21]。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、50 units/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5% CO2。

1.3.5 細(xì)胞毒性測(cè)試(MTT)

為研究確定體外消化液對(duì)HepG2細(xì)胞的最佳上樣濃度，對(duì)1.3.2中所得到的薏米、紅豆、蕎麥、青稞模擬體外消化后的樣品進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。采用MTT法，將HepG2細(xì)胞以8 000 cells/孔的數(shù)量接種到96孔板中，每孔100 μL，邊緣用PBS填充，鋪好板后蓋上蓋子，十字搖勻，不要旋轉(zhuǎn)搖晃，于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)中培養(yǎng)24 h。將四種雜糧的消化產(chǎn)物用培養(yǎng)液溶解，配制成0～20 mg/mL濃度梯度，換掉96孔板中的培養(yǎng)液，加入樣品液，不含樣品的培養(yǎng)液視為對(duì)照組。每孔100 μL，設(shè)3個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，每孔加入120 μL MTT(0.1 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀下檢測(cè)490 nm下各孔的吸光值。

實(shí)驗(yàn)中設(shè)凋零孔、對(duì)照孔及加藥孔。

凋零孔：不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基、MTT、DMSO；對(duì)照孔：細(xì)胞懸液、藥物溶劑、MTT、DMSO；加藥孔：細(xì)胞懸液、不同濃度藥物、MTT、DMSO。

1.3.6 HepG2高脂模型的建立及鑒定

將 HepG2細(xì)胞接種于6孔板，孵育24 h后取出，設(shè)置對(duì)照組和模型組；對(duì)照組加含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，模型組加含終濃度2.5 mmol/L油酸的8%～10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基；將6孔板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h后去除培養(yǎng)液，再充分裂解細(xì)胞，得細(xì)胞裂解液；將細(xì)胞裂解液離心，取上清液測(cè)定 TG和LDL-C 含量。當(dāng)模型組比對(duì)照組細(xì)胞的TG和LDL-C含量顯著提高，同時(shí)結(jié)合油紅染色后在顯微鏡下能明顯觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴時(shí)即HepG2細(xì)胞高脂模型構(gòu)建成功[22]。

用天平稱取0.500 0 g 油紅干粉(已預(yù)先粉碎)，溶于適量異丙醇中，待溶解后，加異丙醇定容至 100 mL，混合均勻。用錫紙遮光保存，此染液為儲(chǔ)存液，可 4 ℃長(zhǎng)期保存。用時(shí)取6 mL，雙蒸水稀釋至10 mL，混勻，濾紙過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗2次；加入10%福爾馬林溶液固定0.5 h；PBS 洗兩次；每孔加入1 mL的油紅O稀釋液，染色10 min；加入2 mL 75%酒精脫色，洗去多余染料；滴一到兩滴于標(biāo)本上，注意排除氣泡，用鑷子夾持蓋玻片，讓蓋玻片的一側(cè)先接觸甘油，再緩緩放下，用濾紙吸掉邊上多余的甘油，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴，拍照。

1.3.7 降脂活性(TG、LDL)測(cè)定

細(xì)胞經(jīng)上述步驟分組培養(yǎng)24 h后分別加入4種模擬消化后雜糧提取物樣品，并設(shè)置空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸除培養(yǎng)液，PBS輕柔洗滌3次，加入IP細(xì)胞裂解液，冰浴裂解細(xì)胞30 min，分別按照甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)測(cè)試盒操作說明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG及LDL-c含量。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說明測(cè)定細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量。用蛋白含量校準(zhǔn)細(xì)胞中TG及LDL-c含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，應(yīng)用Origin 8.5進(jìn)行圖形繪制，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬體外消化過程4種雜糧中酚類物質(zhì)含量的變化

模擬體外消化過程對(duì)4種雜糧(薏米、蕎麥、青稞、紅豆)中的總酚和總黃酮的影響如表1所示。在模擬口腔、胃及小腸消化階段，4種雜糧中的酚類物質(zhì)有顯著變化。4種原料中，紅豆由于其紅色種皮中含有大量游離多酚[23]，因此原料中總酚含量最高，并且在整個(gè)消化階段基本保持穩(wěn)定。而薏米由于其原料中總黃酮含量較低，因此在消化過程中也保持穩(wěn)定。在薏米、蕎麥和青稞中，隨著消化過程其中的總酚含量不斷增加。其中又以蕎麥增加最多，即消化后其中的總酚含量達(dá)到(27.78±0.14) mg GAE/100 g，比其在原料中增長(zhǎng)了36.18%。該結(jié)果說明消化過程對(duì)薏米、蕎麥和青稞中游離多酚的釋放具有顯著影響。該結(jié)果與Espinosa-Alonso等[24]對(duì)淺色種皮谷物在體外消化過程中多酚的釋放量趨勢(shì)呈一致。在蕎麥、青稞、紅豆中，隨著消化過程其中的總黃酮含量不斷增加。其中也是以蕎麥增加最多，即消化后其中的總黃酮含量從(10.83±0.46) mg RE/100 g增長(zhǎng)到(17.11±0.65)mg RE/100 g， 增長(zhǎng)率達(dá)到57.9%。體外消化過程中總酚和總黃酮含量的升高可能是由于雜糧原料中酚類物質(zhì)可與淀粉、蛋白質(zhì)、多糖等天然化合物發(fā)生復(fù)合，形成穩(wěn)定且不易釋放的復(fù)合物[25]。模擬消化過程中由于極端pH值環(huán)境、胃蛋白酶和胰酶等作用下使多糖分離，淀粉和蛋白質(zhì)酶解，有研究報(bào)道胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)促使羧基斷裂，胰酶中含有的胰脂肪酶能水解酯鍵，胰淀粉酶具有水解淀粉中糖苷鍵的功效從而使多酚失去束縛被釋放出來，使雜糧在不同消化階段提取液中酚類物質(zhì)明顯升高[26]。因此，在4種雜糧中蕎麥具有最佳的生物利用度，經(jīng)過體外消化后具有最高的總酚含量及黃酮增長(zhǎng)率。

表1 模擬體外消化過程4種雜糧中酚類物質(zhì)(總酚、總黃酮)釋放量變化

注：同行不同字母表示具有顯著差異(P<0.05,n=3)。

2.2 模擬體外消化后雜糧提取物細(xì)胞毒性測(cè)試

為研究確定體外消化液對(duì)HepG2細(xì)胞的最適作用濃度，采用0、2.5、5、10、20 mg/mL濃度的樣品進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。結(jié)果由圖1可知，在樣品孵育濃度為2.5 mg/mL時(shí)，經(jīng)4種樣品培養(yǎng)24 h后，HepG2細(xì)胞均能保持90%活力并無顯著差異。此后隨著樣品濃度升高，四組細(xì)胞活力均有不同程度的下降。因此，濃度為2.5 mg/mL的4種雜糧體外消化液均不具有細(xì)胞毒性，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最適作用濃度。

圖1 不同濃度的四種消化后雜糧多酚提取物 對(duì)HepG2細(xì)胞活性影響

2.3 HepG2細(xì)胞高脂模型的建立

圖2a為對(duì)照組即正常HepG2細(xì)胞的形態(tài)圖；圖2b為經(jīng)油酸誘導(dǎo)后HepG2細(xì)胞形態(tài)，可以觀察到細(xì)胞中產(chǎn)生了脂滴；圖2c和圖2d為模型組即高脂HepG2細(xì)胞油紅染色后的形態(tài)圖，脂溶性染料可溶于組織和細(xì)胞中的脂類，其在脂類中的溶解度遠(yuǎn)比在溶劑中大，當(dāng)細(xì)胞置入染液時(shí)，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)中，使細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈橘紅色，因此圖2表明細(xì)胞經(jīng)油酸處理后已有大量脂質(zhì)存在[27]。

對(duì)照組和模型組HepG2細(xì)胞的TG、LDL-C 含量見圖3，由圖3可以看出，模型組HepG2細(xì)胞的TG含量和LDL-C 含量顯著高于對(duì)照組(正常HepG2細(xì)胞)。同時(shí)結(jié)合顯微鏡下觀察到模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)橘紅色脂滴，表明HepG2細(xì)胞高脂模型構(gòu)建成功，模型組細(xì)胞即為HepG2細(xì)胞高脂模型[22,27]。

注：a油酸誘導(dǎo)前細(xì)胞形態(tài)；b油酸誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)；c經(jīng)油紅染色后細(xì)胞形態(tài)；d 經(jīng)油紅染色后細(xì)胞三維立體圖。
圖2 油酸誘導(dǎo)前后HepG2細(xì)胞中脂滴聚集形態(tài)

圖3 經(jīng)油酸誘導(dǎo)后的HepG2細(xì)胞中甘油三酯 及低密度脂蛋白含量變化

2.4 模擬體外消化后雜糧提取物對(duì)高脂細(xì)胞模型TG、LDL-c水平的影響

如圖4所示，高脂模型組和對(duì)照組相比，低密度脂蛋白和甘油三酯濃度 (P<0.05)明顯增高。隨著四種雜糧多酚提取物的添加，薏米、蕎麥及紅豆干預(yù)組中甘油三酯的濃度均有顯著下降，其中蕎麥干預(yù)組與模型組相比甘油三酯濃度下降了1/3，達(dá)到(0.156±0.032) mmol/g prot。此外，4種雜糧干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白含量同樣均顯著下降，其中蕎麥組下降至(0.025±0.005) mmol/g prot，說明其對(duì)高脂細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白的抑制具有良好的預(yù)防作用。低密度脂蛋白攜帶膽固醇到外圍組織細(xì)胞，可被氧化成氧化性低密度脂蛋白；當(dāng)氧化修飾后的低密度脂蛋白(OX-LDL)含量過高，膽固醇會(huì)積聚在動(dòng)脈壁，長(zhǎng)時(shí)間后可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化。所以低密度脂蛋白夜被稱為“壞的膽固醇”[28]。因此，4種雜糧消化液的作用不僅有利于改善血脂水平而且對(duì)于脂代謝異常而引起的心腦血管疾病具有一定的預(yù)防作用，其中又以蕎麥作用最佳。

注: 圖中不同字母表示具有顯著差異,P<0.05,n=3。
圖4 經(jīng)2.5 mg/ mL雜糧多酚提取物孵育24 h前后 HepG2細(xì)胞中(a)低密度脂蛋白(b)甘油三酯含量

3 結(jié)論

本研究建立了體外模擬消化模型研究我國(guó)4種常見雜糧(薏米、蕎麥、青稞、紅豆)的降脂活性。通過口腔-胃-小腸體外消化法來測(cè)定雜糧中酚類物質(zhì)的生物利用度，并構(gòu)建完整的HepG2高脂細(xì)胞模型測(cè)定其消化液的降脂活性，初步確定了具有最佳生物利用度和降脂活性的單品。研究結(jié)果表明，在4種雜糧中蕎麥具有最佳的生物利用度，經(jīng)過體外消化后具有最高的總酚含量及黃酮增長(zhǎng)率。以油酸誘導(dǎo)HepG2建立的高脂細(xì)胞中，在2.5 mg/mL濃度的多酚提取物的作用下，薏米、蕎麥及紅豆干預(yù)組中甘油三酯的濃度顯著下降，同時(shí)4種消化液干預(yù)組中細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白含量均顯著下降，其中蕎麥干預(yù)組與模型組相比甘油三酯濃度下降了1/3，低密度脂蛋白降至0.025 mmol/g prot，表現(xiàn)出最佳的降脂活性。因此，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)蕎麥消化液中酚類物質(zhì)的組成及含量進(jìn)行進(jìn)一步分析確定，并通過轉(zhuǎn)運(yùn)模型及代謝組學(xué)研究其吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。