產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其發(fā)酵牛奶的工藝優(yōu)化

侍寶路 王梓旭 胡丹丹 王計(jì)偉 劉春雪

（安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司，江蘇太倉(cāng)215437）

乳酸菌素由乳酸菌菌體細(xì)胞中核糖體合成的對(duì)近源微生物具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或者多肽，但產(chǎn)生菌對(duì)其具有耐受作用[1]。根據(jù)乳酸菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和分子特征，可將其分為三大類：羊毛硫細(xì)菌素、小分子熱穩(wěn)定多肽和大分子熱不穩(wěn)定蛋白[2]。乳酸菌素類型不同造成抑菌機(jī)理不同，總的來說包括細(xì)胞壁損傷機(jī)制、阻礙細(xì)胞分裂和細(xì)胞膜損傷機(jī)制[3]，由于其廣譜抑菌、無(wú)毒素殘留、無(wú)耐藥性等特性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料行業(yè)中[4]。近年來大量使用抗生素的弊端日益嚴(yán)重，畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)升級(jí)面臨巨大挑戰(zhàn)，而隨著乳酸菌素的廣譜抑菌效果不斷被發(fā)現(xiàn)，其替代抗生素用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病具有廣闊的前景[5-6]。

乳酸菌素在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用可通過體表用藥和口服方式來預(yù)防和治療病源感染疾病，以達(dá)到促進(jìn)生長(zhǎng)的效果[7-8]。乳酸菌素在飼料中的應(yīng)用，可改善肉雞生長(zhǎng)性能，提高其抗氧化功能[9]，與抗生素達(dá)到相同的效果[10]；可提高犢牛對(duì)飼料的消化吸收，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)生長(zhǎng)[11-12]。乳酸菌素產(chǎn)生菌來自發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道、糞便及變質(zhì)食品中，其種屬主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconstoc）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等[13]。

哺乳階段仔豬的腸道發(fā)育未成熟，腸道微生物生態(tài)平衡未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此階段使用抗生素會(huì)破壞仔豬腸道微生物的定植過程，進(jìn)而影響動(dòng)物腸道免疫力。前人對(duì)乳酸菌素的研究多集中在產(chǎn)生菌株的篩選、鑒定和培養(yǎng)條件方面[14-16]，對(duì)乳酸菌素應(yīng)用型產(chǎn)品工藝研究較少。人用藥品乳酸菌素標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定乳散菌素是脫脂牛乳經(jīng)嗜酸乳酸菌（Lacidophilus）發(fā)酵制成的粉末，但飼料用乳酸菌素暫無(wú)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過篩選高產(chǎn)乳酸菌素菌株，優(yōu)化產(chǎn)品發(fā)酵工藝，將其變成經(jīng)濟(jì)實(shí)用的腸道保健品，為綠色健康養(yǎng)殖提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

11株受試乳酸菌，標(biāo)號(hào)S1～11來自安佑集團(tuán)微生物研究所菌種庫(kù)；3株指示菌為大腸埃希菌Escherichia coli ATCC25922，鼠傷沙門氏菌Salmonella typhimurium CMCC50115，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923，用于目標(biāo)菌的抑菌譜實(shí)驗(yàn)，來自廣東省微生物菌種保藏中心，由安佑研究院微生物研究所保存。酵母浸粉購(gòu)于安琪酵母股份有限公司；食品級(jí)無(wú)水葡萄糖購(gòu)于山東天力藥業(yè)有限公司；脫脂奶粉購(gòu)于新西蘭恒天然集團(tuán)；MRS 固體、液體培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；MHA、MHB培養(yǎng)基均購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；過氧化氫酶、胃蛋白酶（豬源）、胰蛋白酶，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 發(fā)酵液的制備

將冷凍的11 株乳酸菌甘油管置于室溫融化，分別使用無(wú)菌接種環(huán)挑取適量菌液劃線接種于MRS 固體培養(yǎng)基，36 ℃恒溫倒置培養(yǎng)36 h。挑單菌落至MRS 液體培養(yǎng)基中，于36 ℃培養(yǎng)8 h，菌液濃度為108CFU/ml，作為液態(tài)發(fā)酵劑。將液態(tài)發(fā)酵劑以2%的接種量接種于10%脫脂乳中，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，發(fā)酵脫脂乳在8 000 r/min下離心30 min，棄除沉淀，保留上清液，備用。

1.3 指示菌的培養(yǎng)

分別挑一環(huán)試管斜面指示菌接種于10 ml MHB肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃恒溫培養(yǎng)，使其濁度與0.5 麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁芟嗤簼舛葹?08CFU/ml，若培養(yǎng)后濁度偏高，則可用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濁度，4 ℃保藏備用。

1.4 產(chǎn)乳酸菌素菌株初篩

將MHA培養(yǎng)基煮沸冷卻至50 ℃左右，無(wú)菌操作取1 ml指示菌液至滅菌培養(yǎng)皿中，傾注20 ml MHA培養(yǎng)基，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，置于水平臺(tái)面，待其凝固。用外徑8 mm 的打孔器在完全凝固q 的含菌平板上打孔，用滅菌牙簽挑出孔徑中培養(yǎng)基，每個(gè)孔加入約100 μl 發(fā)酵液。將加完發(fā)酵液的平板正置于(36±1) ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)16～18 h，觀察并測(cè)量抑菌圈的大小，篩選出5 株抑菌效果較好的乳酸菌。

1.5 產(chǎn)乳酸菌素菌株復(fù)篩

1.5.1 酸抑制作用的排除[17]

用1.0 mol/l的氫氧化鈉溶液中和發(fā)酵液至pH值4.5，以pH值為4.5的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照組，以大腸埃希菌作為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.5.2 過氧化氫作用的排除

將發(fā)酵液加入過氧化氫酶處理，以大腸埃希菌作為指示菌，采用打孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，檢測(cè)抑菌活性。

1.5.3 蛋白酶酶解試驗(yàn)

將發(fā)酵液加入胃蛋白酶（豬源）和胰蛋白酶處理，以大腸埃希菌作為指示菌，采用打孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，檢測(cè)抑菌活性。

1.6 發(fā)酵牛奶工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以10%脫脂乳為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，S-1菌株接種量為2%，分別用不同的添加量的葡萄糖（0、5、10、15，20 g/l）和酵母粉（0、2、4、6、8 g/l）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，前處理同2.1 節(jié)，以大腸埃希菌作為指示菌，用打孔法做抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，確定最優(yōu)的葡萄糖和酵母膏的添加量。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，接種量(A)、起始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，大腸埃希菌作為指示菌，以發(fā)酵液的抑菌圈大?。ㄒ志Ч榭疾熘笜?biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007 處理后，采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

2.1.1 產(chǎn)乳酸菌素菌株初篩

豬的常見細(xì)菌性疾病中，仔豬下痢、滲出性皮炎和副傷寒分別與大腸埃希氏菌、葡萄球菌和沙門氏菌感染有關(guān)，故分別以大腸埃希氏菌Escherichia coli ATCC25922，鼠傷沙門氏菌Salmonella typhimurium CMCC50115 和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923 為指示菌，采用打孔法對(duì)11 株乳酸菌的抑菌活性進(jìn)行比較，其結(jié)果見表2。由表2可知，所選乳酸菌的發(fā)酵液對(duì)3 株致病菌均有不同程度的抑菌效果，其中對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌效果最佳，鼠傷沙門氏菌的抑菌效果次之，金黃色葡萄球菌的抑菌效果最差。S-1、S-2、S-3、S-6和S-9的抑菌圈直徑均大于10 mm，抑菌效果較好。

2.1.2 酸抑制作用排除

仔豬細(xì)菌性腹瀉原因多為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染，產(chǎn)乳酸菌素菌株復(fù)篩抑菌試驗(yàn)指示菌選用大腸埃希氏菌ATCC25922。使用氫氧化鈉中和發(fā)酵液中的有機(jī)酸，以大腸埃希氏菌作為指示菌，打孔法檢測(cè)抑菌活性，其結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，當(dāng)MRS 液體培養(yǎng)基pH 值調(diào)為4.5 時(shí)，對(duì)指示菌無(wú)抑制作用，而發(fā)酵液在調(diào)pH 值后存在抑菌圈，說明發(fā)酵液中除有機(jī)酸外，存在其他抑菌物質(zhì)。排除有機(jī)酸對(duì)抑菌活性影響方面，S-6 活性下降率最高，S-1 活性下降率最低。

表2 初篩乳酸菌的抑菌效果（mm）

表3 有機(jī)酸排除試驗(yàn)

2.1.3 過氧化氫作用的排除

使用過氧化氫酶處理發(fā)酵液，以大腸埃希氏菌為指示菌，抑菌效果測(cè)定結(jié)果如表4。由表4可知，經(jīng)過氧化氫酶處理，S-9的發(fā)酵液抑菌活性下降率較大，對(duì)其余4株乳酸菌的發(fā)酵液抑菌活性影響較小。

表4 過氧化氫作用的排除

2.1.4 蛋白酶水解試驗(yàn)

取S-1、S-2、S-3、S-6和S-9菌株發(fā)酵液，經(jīng)胃蛋白酶（豬源）和胰蛋白酶處理后，以大腸埃希氏菌作為指示菌，抑菌效果見表5。由表5 可知，5 株菌發(fā)酵液經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抑菌活性均下降，其中S-6菌株對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈最小，其抑菌活性下降了29.54%，但S-1和S-3菌株的抑菌活性下降得較少，分別為6.06%和8.05%，說明其對(duì)胃蛋白酶（豬源）和胰蛋白酶不敏感。綜上所述，確定S-1菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，即細(xì)菌素，且為產(chǎn)乳酸菌素最優(yōu)菌株，且所用的胃蛋白酶（豬源）和胰蛋白酶篩選效果更貼近實(shí)際應(yīng)用時(shí)菌株代謝物的抑菌效果。

表5 蛋白酶水解試驗(yàn)

2.2 發(fā)酵牛奶工藝優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖和酵母浸膏添加量對(duì)菌株S-1 抑菌活性影響

以10%脫脂乳為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同含量的葡萄糖，以大腸埃希氏菌為指示菌，抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1 知隨著葡萄糖添加量的增加，抑菌活性先上升后下降，在葡萄糖添加量在10 g/l時(shí)，抑菌活性最高，為15.13 mm。酵母浸粉添加量對(duì)菌株S-1抑菌活性的影響見圖2，隨著酵母浸粉添加量的增加，抑菌活性先上升后下降，在酵母浸粉添加量在6 g/l 時(shí)，抑菌活性最高，為15.63 mm。

圖1 葡萄糖添加量對(duì)菌株S-1抑菌活性的影響

圖2 酵母浸粉添加量對(duì)菌株S-1抑菌活性的影響

2.2.2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，影響菌株S-1 對(duì)大腸埃希氏菌抑菌活性的主次因素為發(fā)酵溫度＞起始pH 值＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量。本試驗(yàn)最優(yōu)發(fā)酵工藝為：A3B2C2D2，即接種量4%，起始pH 值為6，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)公告在今年7 月10 日正式發(fā)布，要求在2020 年底以前，飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端減抗、降抗為必然，乳酸菌素作為綠色飼料添加劑成為替抗方案的一種選擇。產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株篩選早已成為研究熱點(diǎn)：尚楠等[16]從32 株人腸道雙歧桿菌中分離出具有廣譜抗菌效果的雙歧桿菌L-SN，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌、單菌李斯特菌等致病菌有顯著作用；張梅梅等[18]對(duì)分離自牦牛酸奶中的26 株乳酸菌進(jìn)行篩選，得到5 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，為干酪乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳球亞種，能抑制部分食源性革蘭氏陽(yáng)性和陰性致病菌，對(duì)真菌無(wú)抑菌活性；張艾青等[19]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的267 株乳酸菌中，分離出1 株具有較強(qiáng)抑菌作用的產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的植物乳桿菌P158；Garzon 等[20]從亞馬遜野生熱帶水果中分離出1 株產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌，經(jīng)鑒定細(xì)菌素Cys5-4 能夠有效抑制大腸桿菌和沙門氏菌生長(zhǎng)；Noda 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，從柑橘水果中分離得到的短乳桿菌174A，產(chǎn)生抗菌多肽174A-β和174A-γ，能夠有效抑制單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌。因此，不同來源和不同種屬的乳酸菌均可能產(chǎn)生不同種類細(xì)菌素。本研究中，從安佑微生物研究所菌種庫(kù)優(yōu)選11 株乳酸菌，經(jīng)篩選得到菌株S-1 產(chǎn)細(xì)菌素并有效抑制大腸埃希氏菌，但其菌株鑒定、生物學(xué)特性及細(xì)菌素成分鑒定還有待進(jìn)一步深入研究。

3.2 發(fā)酵牛奶工藝優(yōu)化

脫脂乳作為一種天然的培養(yǎng)基，富含蛋白質(zhì)（酪蛋白為主）、碳水化合物（乳糖為主）、礦物質(zhì)和維生素，是良好的載體和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)源，而葡萄糖和酵母浸粉作為乳酸菌良好的營(yíng)養(yǎng)源已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中。Papagianni 等[22]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源影響細(xì)菌素合成，與蔗糖和果糖相比，葡萄糖作為碳源時(shí)，乳酸菌發(fā)酵生物量最大且發(fā)酵上清液抑菌活性最高。高濃度酵母提取物能夠提高細(xì)菌素產(chǎn)量和活性[23]。本研究結(jié)果表明，在10%脫脂乳中添加葡萄糖與酵母浸粉能夠提高菌株S-1發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性，與前人研究結(jié)果一致，綜合生產(chǎn)成本和抑菌效果因素，確定葡萄糖和酵母浸粉最佳添加量為10 g/l和6 g/l。

通常認(rèn)為細(xì)菌素產(chǎn)生與產(chǎn)生菌生長(zhǎng)階段相關(guān)聯(lián)，有的細(xì)菌素在菌體細(xì)胞生長(zhǎng)剛開始時(shí)產(chǎn)生，而有的細(xì)菌素則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期才會(huì)產(chǎn)生，而發(fā)酵工業(yè)上，接種量的大小明顯影響延滯期的長(zhǎng)短，通常采用較大的接種量，縮短發(fā)酵周期，以快速到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。本研究中最佳接種量為4%，原因可能是菌株S-1 產(chǎn)生細(xì)菌素的階段是生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期，加大接種量以快速到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，有利于細(xì)菌素產(chǎn)生，這也與前人的研究一致[24]。本研究中最適培養(yǎng)時(shí)間是36 h，其原因可能是培養(yǎng)后期菌體自溶釋放蛋白酶降解細(xì)菌素，同時(shí)細(xì)菌素吸附到產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞表面引起發(fā)酵液中細(xì)菌素活性降低[25]。乳酸菌素的產(chǎn)生或許是一種應(yīng)激調(diào)節(jié)，對(duì)不適于最佳生長(zhǎng)環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)[26]，這種應(yīng)激反應(yīng)由一個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)觸發(fā)，該系統(tǒng)是由一種能夠感知特定環(huán)境刺激的膜結(jié)合組氨酸蛋白激酶和一種介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)器組成[21]。培養(yǎng)溫度影響微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝過程，但其生長(zhǎng)率最高時(shí)溫度與累積代謝產(chǎn)物最高時(shí)溫度并不相同[27]。乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度多在30～40 ℃，中性和偏堿性環(huán)境并不利于乳酸菌生長(zhǎng)[28]。Zhou 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿BC-25最適生長(zhǎng)溫度和pH 值為35 ℃和6.8，而產(chǎn)細(xì)菌素的最佳溫度和pH 值范圍分別是27～34 ℃和6.35～6.65，而本試驗(yàn)結(jié)果表明最佳發(fā)酵溫度和起始pH 值分別是36 ℃和6，研究結(jié)果間差別可能是來自乳酸菌種屬間差異，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

以大腸埃希氏菌ATCC25922、鼠傷沙門氏菌CMCC50115、金黃色葡萄球菌ATCC25923 為指示菌，篩選了實(shí)驗(yàn)室保存的11 株乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌活性，排除有機(jī)酸和過氧化氫的干擾及通過蛋白酶敏感性試驗(yàn)，得到優(yōu)產(chǎn)細(xì)菌素菌株為S-1。以10%脫脂乳為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，葡萄糖和酵母浸粉的最佳添加量分別為10 g/l 和6 g/l，最優(yōu)發(fā)酵工藝為接種量4%，起始pH 值為6，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。本研究提供一種動(dòng)保用乳酸菌素產(chǎn)品發(fā)酵方案，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但其在動(dòng)物生產(chǎn)上應(yīng)用效果還需進(jìn)一步研究。