犬卵透明帶3 DNA疫苗在小鼠模型中的避孕效果評價

王穎， 張富春

(1. 新疆大學(xué)紡織與服裝學(xué)院，烏魯木齊830046； 2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，犬Canislupusfamiliaris作為寵物伴侶進入了千家萬戶，寵物犬數(shù)量不斷增多的同時，越來越多的流浪犬出現(xiàn)在城市的大街小巷中。龐大數(shù)量的流浪犬不僅嚴重影響人們的日常生活、城市的環(huán)境衛(wèi)生，還增加了人們罹患各種疾病的危險(王金霞，2016)。因為流浪犬不僅是狂犬病的宿主，還是諸多寄生蟲的中間或終末宿主(李斌等，2016；汪天平，操治國，2018)。目前控制流浪犬數(shù)量主要是通過棒殺、毒殺、絕育等方法，這些方法都存在一些局限性，無法廣泛并有效應(yīng)用于控制流浪犬數(shù)量(莊心依等，2017)。避孕疫苗是利用在生殖過程中具有重要作用的蛋白或激素作為靶標抗原，免疫動物后控制其生育的一種方法，相比傳統(tǒng)控制流浪犬數(shù)量的方法，其具有低成本、環(huán)保、符合動物福利等優(yōu)點(樊姝彤等，2017)。但是目前還沒有能高效控制流浪犬生育數(shù)量的避孕疫苗商品，因此開發(fā)一款能有效控制流浪犬數(shù)量的避孕疫苗具有良好的市場前景。

卵透明帶(zona pellucida，ZP)是一種特殊的細胞外透明基質(zhì)，圍繞在排出的卵子和早期胚胎周圍(Nixonetal.，2007)，其形成對卵巢卵泡的發(fā)育、受精、囊胚形成、早期胚胎的運輸必不可少(Talbotetal.，2003；Nixonetal.，2007)。ZP基質(zhì)主要由ZP1、ZP2、ZP3糖蛋白構(gòu)成(Spargo & Hope，2003)，其中，ZP3作為精子的初級受體，在精子與卵子結(jié)合和激發(fā)精子頂體反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Bagavantetal.，1997；Srivastaveetal.，2002)。研究表明，用ZP3作為靶抗原的蛋白疫苗免疫犬(Srivastaveetal.，2002)、兔Oryctolaguscuniculus(Mackenzieetal.，2006)、灰袋鼠Macropusgiganteus(Kitcheneretal.，2009a)、樹袋熊Phascolarctoscinereus(Kitcheneretal.，2009b)和小鼠Musmusculus(Guptaetal.，2013；Shresthaetal.，2014，2015)等都取得了良好的避孕效果。但是純化ZP3重組蛋白的生產(chǎn)成本高、工藝繁瑣，且蛋白不易保存，因此很難在臨床實踐中廣泛應(yīng)用。DNA疫苗是一種將編碼靶標抗原的重組真核表達載體通過肌肉、皮下或黏膜途徑給人或動物免疫后，使外源基因在活體內(nèi)表達，激活機體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)機體特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答的方法。與傳統(tǒng)的蛋白疫苗相比，DNA疫苗更穩(wěn)定(Sasakietal.，2003；Sunetal.，2010)、更經(jīng)濟(Sasakietal.，2003)、維持免疫原性時間長，且易于生產(chǎn)(Alarconetal.，1999；Robinson & Pertmer，2000)。本研究以犬卵透明帶3(CZP3)為靶蛋白制備了CZP3 DNA疫苗，在小鼠模型上注射后輔以電脈沖刺激以增強DNA疫苗的免疫效果，對其避孕效果進行了初步的評價，為CZP3 DNA 避孕疫苗在流浪犬上的推廣應(yīng)用建立了基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實驗試劑及材料

pcDNA3、pcDNA3-CZP3由本實驗室保存及構(gòu)建。6～8周齡12只BALB/c小鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，購自北京維通利華，比格犬卵巢由新疆醫(yī)學(xué)院科技樓惠贈。CZP3c重組蛋白為本實驗室純化并保存。HRP標記的山羊抗小鼠二抗、FICT標記的兔抗鼠二抗、BSA購自生工生物工程(上海)股份有限公司，孕馬血清(PMSG)、人絨毛促性腺激素(hCG)購自寧波第二激素廠，透明質(zhì)酸酶購自Sigma。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 質(zhì)粒的提取、純化及定量

按《分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(張富春等，2008)中的實驗步驟，對pcDNA3、pcDNA3-CZP3進行質(zhì)粒的提取及純化。用紫外分光光度儀定量滅菌生理鹽水溶解純化后的質(zhì)粒，使其終濃度為1 μg·μL-1。

1.3 小鼠免疫

12只BALB/c雌性小鼠隨機分為2組(n=6)：實驗組和陰性對照組，第0、2、4周分別向每只小鼠腿部肌肉注射50 μL pcDNA3-CZP3和pcDNA3質(zhì)粒，然后迅速進行6次電脈沖(電壓30 V)刺激。初免后，每周從小鼠眼眶靜脈叢取血，分離血清，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA檢測抗體水平

用純化后的CZP3c重組蛋白作為包被抗原，濃度為10 μg·mL-1。血清的稀釋倍數(shù)為1∶100，山羊抗小鼠二抗的稀釋倍數(shù)為1∶2 000，OD450檢測抗體水平。

1.5 抗體滴度檢測

選擇抗體水平最高的第6周血清進行倍比稀釋，血清按照1∶50、1∶500、1∶1 000、1∶1 200、1∶4 000進行稀釋，ELISA檢測各組的抗體滴度。

1.6 小鼠卵子的間接免疫熒光

取5只BALB/c雌性小鼠進行超數(shù)排卵實驗。每只小鼠肌肉注射12 IU的PMSG，46 h后肌肉注射12 IU的hCG。13 h后處死小鼠，收集壺腹部卵子。用5 IU的透明質(zhì)酸酶室溫消化5 min后，將卵子轉(zhuǎn)移至BMOC培養(yǎng)基制作的液滴中。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗卵子數(shù)次后，計數(shù)，將卵細胞平均分為2組放置于防脫載玻片上。無水乙醇固定后，5%BSA，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中封閉1 h。PBS沖洗3次后，加入一抗(稀釋倍數(shù)為1∶50)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。PBS沖洗3次后，加入FITC標記的兔抗鼠二抗(1∶200)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS充分清洗，甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 犬卵巢切片的間接免疫熒光

比格犬卵巢固定后委托新疆醫(yī)學(xué)院科技樓病理切片室制作成5 μm厚切片。56 ℃烤片1 h后，乙醇脫蠟，檸檬酸鹽微波加熱修復(fù)抗原10 min。切片溫度降至室溫后，用PBST清洗。用含有2%兔血清的PBS 37 ℃孵育封閉1 h。一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜。PBST清洗切片后，加入FITC標記的兔抗鼠二抗(1∶200)，37 ℃孵育30 min。充分清洗后用甘油封片于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 避孕效果檢測

初免后第6周，對每組小鼠進行分籠，每籠3只小鼠。同時每籠放入1只具有生殖能力的雄鼠進行合籠實驗。雄鼠每天輪換1次，3周后取出，計算雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)及生育率。

1.9 組織學(xué)分析

第24周處死小鼠，取出卵巢用4%多聚甲醛固定24 h。卵巢經(jīng)脫水、包埋后，制成2張5 μm厚的連續(xù)切片。切片經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠抗CZP3抗體水平檢測

初免后第2周，實驗組小鼠即產(chǎn)生了抗CZP3的抗體，抗體水平與陰性對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。初免后第3周，實驗組的抗體水平迅速上升，到初免后第6周達到峰值，隨后開始下降，直到初免后第24周，一直維持在一定水平。t檢驗結(jié)果顯示，從初免后第3周到第24周，實驗組的抗體水平與陰性對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 犬卵透明帶3抗體水平檢測Fig. 1 Detection of antibody levels against canine zona pellucida 3

與陰性對照組相比Compared with the negative control group，*P<0.05，***P<0.001； 下同the same below

2.2 抗體滴度檢測

t檢驗結(jié)果顯示，當血清稀釋至1∶4 000倍時，實驗組的抗體滴度與陰性對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 ELISA檢測血清中的抗體效價Fig. 2 Antibody titer of serum detected by ELISA

2.3 間接免疫熒光

間接免疫熒光結(jié)果顯示，實驗組小鼠產(chǎn)生的血清抗體不僅可以識別小鼠卵子的透明帶基質(zhì)(圖3：A)，也可與犬卵巢切片中的卵子外透明帶基質(zhì)結(jié)合(圖3：B)，并且與犬的其他組織無交叉反應(yīng)。

圖3 小鼠卵子(A)與犬卵巢切片(B)的間接免疫熒光實驗Fig. 3 Indirect immunofluorescence assay of mouse oocytes and dog ovarian sections

a， c. pcDNA3， b， d. pcDNA-CZP3； 上upper. 明場bright filed， 下lower. 熒光場fluorescence field

2.4 抗生育效果實驗

實驗結(jié)果顯示，生育率由陰性對照組的100%下降至實驗組的50%；產(chǎn)仔數(shù)由陰性對照組的40只降低到實驗組的15只。χ2檢驗結(jié)果顯示，實驗組(2.500只±1.455只)與陰性對照組(6.667只±0.422只)的產(chǎn)仔數(shù)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示，實驗組抗體水平與產(chǎn)仔數(shù)呈高度負相關(guān)(r=-0.941 1)(圖4)。

圖4 抗體水平與小鼠產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation between antibody levels and litter size of mouse

2.5 小鼠卵巢組織學(xué)分析

卵巢切片顯示，與陰性對照組相比，實驗組懷孕小鼠卵巢的卵泡發(fā)育正常，初級卵泡、次級卵泡以及成熟卵泡數(shù)量均正常；且實驗組小鼠在不孕情況下的卵泡也發(fā)育正常(圖5)。

3 討論

與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有眾多優(yōu)點，如DNA疫苗能夠在轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生“內(nèi)源性”抗原，從而激發(fā)CD4+和CD8+T細胞免疫應(yīng)答，但自Wolff發(fā)明DNA疫苗以來，近30年獲得批準上市的DNA疫苗卻很少(Kutzler & Weiner，2008)。制約DNA疫苗走向臨床應(yīng)用的瓶頸就是相對傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗的免疫原性較差(Kimetal.，2010)。研究人員為此進行了一系列研究，如使用強有力的啟動子(Lukeetal.，2011)、免疫時使用傳統(tǒng)佐劑或分子佐劑(Maetal.，2014；Pengetal.，2014；Almeidaetal.，2015；Bergamaschietal.，2015)、使用靶向DNA疫苗技術(shù)(Fossumetal.，2015；Saigaetal.，2015；Yeetal.，2015)、采用先DNA疫苗免疫再蛋白加強免疫或先蛋白免疫再DNA疫苗加強免疫的免疫策略(Cervantes-Villagranaetal.，2013；Chuangetal.，2013；Fournillieretal.，2013)，或使用基因槍或電脈沖注射質(zhì)粒DNA(Broderick & Humeau，2015；Leeetal.，2015)，以增強機體對DNA疫苗的免疫應(yīng)答。電脈沖注射就是利用電流刺激注射部位的肌肉組織，使DNA質(zhì)粒能夠瞬時透過細胞膜進入胞內(nèi)，從而提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。此外電脈沖還可以促進炎性細胞因子的產(chǎn)生，招募抗原遞呈細胞及T細胞向免疫部位遷移(Leeetal.，2015)。研究顯示，利用電脈沖免疫DNA疫苗在羊Ovisaries(Scheerlincketal.，2004)、牛Bostaurus(Fowleretal.，2012)、犬(Shahbazietal.，2015)、豬Susscrofa(Shengetal.，2016)等動物實驗中都誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強的免疫應(yīng)答。為了增強CZP3 DNA疫苗的避孕效果，本研究采用電脈沖方式對小鼠進行DNA疫苗免疫，電脈沖增強了機體對于DNA疫苗的免疫應(yīng)答，從初免后第2周起，實驗組的抗體水平與陰性對照組之間的差異就有統(tǒng)計學(xué)意義，并且這種差異持續(xù)期近半年。此外，第6周實驗組的抗體滴度為1∶4 000時，與陰性對照組之間的差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 陰性對照組(左)和實驗組(中， 右)小鼠卵巢的組織胚胎學(xué)分析Fig. 5 Histological analysis of the negative control group (left) and the experiment group (middle and right) mice ovary

左、中. 懷孕小鼠， 右. 不孕小鼠

Left， middle. pregnant mouse， right. infertile mouse

研究表明，以ZP3為靶抗原的避孕疫苗主要是通過2種機制介導(dǎo)不孕：一種機制認為動物免疫ZP3后產(chǎn)生充足的抗體結(jié)合于卵子外周的ZP上，阻斷了精子與卵子的結(jié)合誘導(dǎo)不孕，因此ZP3的抗體水平對于誘導(dǎo)不孕至關(guān)重要，當ZP3的抗體水平達到某一臨界值時即誘導(dǎo)不孕(Jacksonetal.，1998；Hardyetal.，2002；Lloydetal.，2003)；另一種則認為ZP3在ZP的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抗ZP3的抗體與ZP3結(jié)合后會破壞ZP3的功能，導(dǎo)致形成ZP的厚度減小。此外，抗ZP3的抗體干擾顆粒細胞緊密附著于卵子，減少了顆粒細胞與卵子的聯(lián)系，導(dǎo)致卵泡的異常發(fā)育，成熟卵泡的減少，誘發(fā)卵巢功能早衰。這些卵巢組織結(jié)構(gòu)上的改變協(xié)同作用導(dǎo)致了免疫動物的不孕(Maetal.，2012a， 2012b；Tuetal.，2013；Guptaetal.，2015)。間接免疫熒光實驗顯示，CZP3抗體可以結(jié)合于小鼠的ZP基質(zhì)上，從而阻斷精子與ZP的結(jié)合。此外，CZP3的抗體水平與產(chǎn)仔數(shù)呈負相關(guān)，即抗體水平越高，小鼠的產(chǎn)仔數(shù)越少，說明當抗CZP3的抗體水平達到某一特定值后可導(dǎo)致小鼠不孕。小鼠的卵巢組織學(xué)分析顯示，免疫CZP3后抗CZP3的抗體并沒有對不孕及懷孕小鼠的卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育產(chǎn)生影響，這進一步說明，導(dǎo)致小鼠不孕是抗CZP3的抗體所致。在間接免疫熒光實驗中，抗CZP3的抗體不僅可以結(jié)合于犬的ZP上，還可以結(jié)合于小鼠的ZP上，這可能與CZP3與小鼠的ZP3氨基酸序列具有66.8%的相似性(王穎等，2016)相關(guān)。

本研究輔以電脈沖的方式對小鼠注射CZP3 DNA疫苗，增強了小鼠免疫應(yīng)答的水平，同時顯著降低了小鼠的產(chǎn)仔數(shù)，并且CZP3 DNA疫苗的接種免疫沒有導(dǎo)致小鼠的卵巢發(fā)生病理學(xué)變化，使用安全且具有一定的免疫避孕效果，這為今后開發(fā)安全有效的CZP3 DNA避孕疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)。