低劑量伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)癲癇大鼠皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平的影響

尹 昱，王曉晗，王賀波，孫增鑫，董長(zhǎng)征，李文玲，趙文清，趙振彪

目前關(guān)于伽瑪?shù)墩丈渥鳛殚_(kāi)顱手術(shù)治療癲癇的替代方案的研究日益增多[1-2]。臨床研究[3-4]顯示低劑量伽瑪?shù)犊煽刂齐y治性癲癇患者的癇性發(fā)作，并可保護(hù)該類患者的認(rèn)知功能，但作用機(jī)制仍不十分明確。目前認(rèn)為鈣離子與學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能密切相關(guān)，而研究[5]顯示鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)還可誘發(fā)癇性發(fā)作，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度超過(guò)正常水平，但劑量未達(dá)到產(chǎn)生興奮毒性的程度時(shí)，鈣濃度異常升高可能引起神經(jīng)細(xì)胞異常放電進(jìn)而導(dǎo)致癲癇。低劑量伽瑪?shù)妒欠裢ㄟ^(guò)影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平而發(fā)揮抗癲癇和保護(hù)認(rèn)知的作用，有待進(jìn)一步深入探討。現(xiàn)利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠額葉及海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平，并觀察低劑量伽瑪?shù)秾?duì)其的影響，以期為伽瑪?shù)吨委煱d癇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與癲癇模型制備選取清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠32只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，起始體質(zhì)量180～220 g，均在同一實(shí)驗(yàn)室按清潔級(jí)大鼠要求飼養(yǎng)，22～25℃環(huán)境溫度，12 h光亮/黑暗條件，自由進(jìn)食水。根據(jù)大鼠是否應(yīng)用PTZ致癇及接受低劑量伽瑪?shù)墩丈?，隨機(jī)均分為4組：正常對(duì)照組、伽瑪?shù)秾?duì)照組、PTZ致癇組、PTZ致癇+伽瑪?shù)督M。采用腹腔連續(xù)注射PTZ溶液(Sigma 公司，美國(guó))(35 mg/kg)制備癲癇大鼠模型，每24 h注射1次，連續(xù)注射4周，每次注射后觀察大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作的表現(xiàn)。采用修正RacineⅥ級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作情況進(jìn)行評(píng)定[6]。在大鼠4周連續(xù)應(yīng)用PTZ期間內(nèi)，如Ⅳ級(jí)以上的癲癇發(fā)作連續(xù)出現(xiàn)3次，即被視為癲癇模型制備成功，并用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，此后仍每周腹腔注射1次相同劑量的PTZ以維持發(fā)作。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射同等容量的生理鹽水；伽瑪?shù)秾?duì)照組僅給予伽瑪?shù)墩丈?；PTZ致癇組大鼠由PTZ制備癲癇模型；PTZ致癇+伽瑪?shù)督M大鼠經(jīng)PTZ制備癲癇模型后再接受低劑量伽瑪?shù)墩丈洹?/p>

1.2 低劑量伽瑪?shù)墩丈銹TZ連續(xù)注射4周，癲癇模型制備成功后，應(yīng)用Leksell伽瑪?shù)断到y(tǒng)(ELEKTA，瑞典)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行單次低劑量伽瑪?shù)墩丈洌瑢?shí)驗(yàn)大鼠麻醉后(腹腔注射水合氯醛，35 mg/kg)固定在動(dòng)物架上，再將其置于伽瑪?shù)兜腖eksell框架上，應(yīng)用核磁共振儀(Signa 1.5T)對(duì)大鼠進(jìn)行定位掃描，以大鼠雙側(cè)額葉為照射靶區(qū)，并根據(jù)核磁圖像在Gamma Plan系統(tǒng)上確定雙側(cè)額葉的坐標(biāo)軸，以50%等劑量線包圍靶區(qū)，邊緣劑量為15 Gy，用4 mm準(zhǔn)直器進(jìn)行照射[3]。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)癇性發(fā)作程度的比較(n)

與PTZ致癇組比較：*P<0.05

1.3 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)各組大鼠分別于伽瑪?shù)墩丈浜?2周常規(guī)斷頭迅速取腦，在低溫操作臺(tái)上分離出額葉及海馬組織。經(jīng)DMEM培養(yǎng)基漂洗，用0.25%胰蛋白酶37 ℃恒溫消化30 min，再經(jīng)DMEM培養(yǎng)基漂洗終止消化反應(yīng)。后用不同口徑的玻璃吸管將腦組織輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。懸液經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后，加入鈣離子熒光探針Fluo-3/AM(Biotium 公司，美國(guó))(含0.1% F-127)，終濃度為5 μmol/L。再將細(xì)胞懸液避光孵育30 min(37 ℃)，用DMEM培養(yǎng)基漂洗2～3次。在載玻片上滴一定量的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，再將其放置于激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó))的載物臺(tái)上。先在低倍鏡(×10)下找到懸液中的神經(jīng)細(xì)胞，再在高倍鏡(×20)下選取不同視野的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行掃描。發(fā)射光為530 nm，激發(fā)光為488 nm。以熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的掃描層面為標(biāo)準(zhǔn)值，每個(gè)樣本取20個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，取其平均值作為每樣本的Ca2+熒光像素值。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠模型制備情況實(shí)驗(yàn)大鼠于腹腔注射PTZ 3～6次后出現(xiàn)癇性發(fā)作，如頭面部抽動(dòng)、四肢抽動(dòng)及陣攣、全身肌陣攣發(fā)作、跌倒及周身翻滾等。每次于注射后3～5 min出現(xiàn)，隨著注射數(shù)次增加，發(fā)作程度逐漸加重。每次發(fā)作持續(xù)40～60 min后逐漸緩解。16只大鼠中共有12只模型制備成功，于注射12～16次后連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級(jí)以上的癇性發(fā)作，成功率為75%。

2.2 各組大鼠癲癇發(fā)作情況對(duì)照組及伽瑪?shù)秾?duì)照組大鼠行為正常，無(wú)癇性發(fā)作。PTZ致癇組大鼠連續(xù)注射4周PTZ后每周再次注射時(shí)，絕大部分可出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作。PTZ致癇+伽瑪?shù)督M大鼠經(jīng)低劑量伽瑪?shù)墩丈浜?，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，每周再次注射PTZ，發(fā)作程度逐漸減輕。實(shí)驗(yàn)將Ⅰ～ Ⅲ級(jí)發(fā)作定為輕度，Ⅳ～Ⅴ級(jí)定為重度，于照射后第12周，兩組大鼠發(fā)作差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠額葉皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，伽瑪?shù)秾?duì)照組大鼠額葉及海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度輕度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PTZ致癇組較正常對(duì)照組升高；PTZ致癇+伽瑪?shù)督M較PTZ致癇組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F皮層=20.936、F海馬=26.189，P<0.001)。見(jiàn)表2和圖1、2。

表2 各組大鼠皮層及海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光像素值的比較

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05; 與PTZ致癇組比較：ΔP<0.05

圖1 各組大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度

A：正常對(duì)照組; B：伽瑪?shù)秾?duì)照組; C：PTZ致癇組; D：PTZ致癇+伽瑪?shù)督M

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+ 熒光強(qiáng)度

A：正常對(duì)照組; B：伽瑪?shù)秾?duì)照組; C：PTZ致癇組; D：PTZ致癇+伽瑪?shù)督M

3 討論

Ca2+廣泛分布于機(jī)體細(xì)胞與體液當(dāng)中，作為細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，參與多種生理功能的調(diào)節(jié)。正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)細(xì)胞外的Ca2+濃度約為細(xì)胞內(nèi)的2萬(wàn)倍，細(xì)胞可通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，如細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)攝取及釋放，Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。目前研究[7]表明，Ca2+在各種神經(jīng)退行性疾病的病生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡是癲癇發(fā)生的觸發(fā)因素。關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡影響癲癇發(fā)病的實(shí)驗(yàn)證據(jù)日益增多[8]。癲癇發(fā)作時(shí)大腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+急劇升高超過(guò)閾值，神經(jīng)細(xì)胞受到損傷或異常放電，可能是癲癇發(fā)生的直接原因。Raze et al[9]研究發(fā)現(xiàn)慢性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，并且在致癇后1年神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度仍維持較高水平。 Pal et al[10]將海馬神經(jīng)元在無(wú)Mg2+培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+水平顯著升高，并出現(xiàn)癇性放電。Ghotbeddin et al[11]應(yīng)用膜片鉗實(shí)驗(yàn)表明，杏仁核點(diǎn)燃可增強(qiáng)電壓門(mén)控Ca2+通道電流，而T型Ca2+通道的選擇性阻斷可抑制杏仁核點(diǎn)燃的進(jìn)展[12]。以上研究顯示無(wú)論離體還是在體的癇性神經(jīng)元均存在鈣穩(wěn)態(tài)的變化。本研究顯示，致癇大鼠額葉皮層及海馬的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，與近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道一致。

目前大量資料表明，Ca2+作為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的重要信使與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，Ca2+內(nèi)流入突觸后膜是觸發(fā)形成LTP的必要條件之一。本研究表明PTZ致癇大鼠額葉皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，而癲癇大鼠學(xué)習(xí)和記憶受損[3]，提示鈣穩(wěn)態(tài)失衡與癲癇大鼠的認(rèn)知障礙密切相關(guān)。課題組前期研究[13]還顯示，PTZ致癇大鼠腦組織N-甲基-D-天氡氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體亞基1、NMDA受體2A及NMDA受體2B過(guò)度表達(dá)，故推測(cè)皮層和海馬組織NMDA受體活性增強(qiáng)，可能是導(dǎo)致癲癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平升高的重要機(jī)制。

近年來(lái)研究[14]已證實(shí)伽瑪?shù)墩丈淇捎行У乜刂骑D葉癲癇的癲癇發(fā)作，并對(duì)該類患者的認(rèn)知功能、心理、情緒沒(méi)有明顯影響。目前認(rèn)為低照射劑量(邊緣劑量10～20 Gy)在不損害正常神經(jīng)元的同時(shí)可提高癲癇灶的閾值，產(chǎn)生抗癇作用[15]。但其生物學(xué)作用機(jī)制仍不明確。本研究結(jié)果顯示，邊緣劑量15 Gy的伽瑪?shù)墩丈淇娠@著降低癲癇大鼠皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，而對(duì)正常腦組織影響較小，提示低劑量伽瑪?shù)犊赡苁峭ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)而起到抗癲癇作用的。然而，伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。目前研究集中在電離輻射對(duì)Ca2+異化擴(kuò)散和細(xì)胞膜的Ca2+通道的影響。結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果，低劑量伽瑪?shù)墩丈浜笊窠?jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低可能與癲癇病灶NMDA受體活性減低有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。