氧化石墨烯對(duì)紫花苜蓿幼苗生理生態(tài)特征的影響

朱先貴，趙樹(shù)蘭，多立安

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

碳納米材料是指在三維空間尺度中至少有一維處于納米量級(jí)（1～100 nm）的材料，目前碳納米材料主要有石墨烯（graphene）、碳納米管（carbon nanotubes）、富勒烯（fullerene）等.其中，石墨烯是由碳原子以sp2雜化軌道組成的平面二維晶體.氧化石墨烯（GO）是石墨烯的氧化物，一般由石墨經(jīng)強(qiáng)酸氧化而得，作為一種性能優(yōu)越的新型碳材料，在光電、熱導(dǎo)涂料、太陽(yáng)能電池及環(huán)境污染修復(fù)等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1].同時(shí)，GO的大量使用對(duì)環(huán)境造成的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加，其環(huán)境效應(yīng)逐漸引起研究者的關(guān)注[2-3].目前，關(guān)于GO 環(huán)境效應(yīng)的研究涉及動(dòng)植物以及微生物等各個(gè)方面.如Jia 等[4]的研究表明，GO 會(huì)影響斑馬魚(yú)腸道微生物的多樣性，增加斑馬魚(yú)中的病原細(xì)菌群落，誘導(dǎo)對(duì)腸道組織的損害并激活炎癥反應(yīng).Zhao 等[5]的研究表明，石墨烯對(duì)藻類(lèi)會(huì)構(gòu)成環(huán)境脅迫，藻類(lèi)通過(guò)減少膜損傷和直接接觸的機(jī)會(huì)來(lái)減輕石墨烯材料造成的損傷.Wang 等[6]的研究表明，GO 可以增強(qiáng)殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)的作用效果.

目前關(guān)于GO 對(duì)植物影響的研究多集中在禾本科. 如Shen 等[7]對(duì)水稻的研究發(fā)現(xiàn)，水培時(shí)加入GO（50 mg/L）會(huì)使水稻根長(zhǎng)變短；殷玲玉[8]用水培法培育玉米時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中加入GO（500 mg/L）使玉米苗的鮮重與對(duì)照相比減少了47%；Chen 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，水培時(shí)高濃度的GO（≥0.4 mg/mL）抑制了小麥的萌發(fā).這些研究通常采用水培實(shí)驗(yàn)，土培盆栽很少見(jiàn)，而后者能夠更精準(zhǔn)地模擬GO 輸入到土壤環(huán)境中對(duì)植物生長(zhǎng)的影響.GO 進(jìn)入土壤后對(duì)豆科植物及其固氮特性影響的研究鮮有報(bào)道，而豆科植物作為地球生物固氮的主體，生態(tài)價(jià)值極其重要[10-11].本研究以常見(jiàn)的豆科根瘤共生固氮植物紫花苜蓿（Medicago sativa）為模式植物，采用土培方式，觀察紫花苜蓿在生長(zhǎng)和生理生態(tài)特征方面對(duì)GO 脅迫作出的響應(yīng)，以期為深入探討GO 對(duì)豆科植物固氮作用機(jī)制的影響以及GO 應(yīng)用對(duì)自然界生物固氮的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫花苜蓿種子，購(gòu)于北京正道種業(yè)有限公司.氧化石墨烯（GO），購(gòu)自蘇州碳豐科技有限公司，為褐黃色粉末，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%，平均厚度3.4～8.0 nm，片層直徑10～50 μm，層數(shù)5～10 層，比表面積100～300 m2/g.土培基質(zhì)取自天津師范大學(xué)校園內(nèi)生物學(xué)試驗(yàn)區(qū)10～20 cm 深度的土壤，含鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，有機(jī)質(zhì)4.68%，全氮0.22%，全鉀45.61%，有效磷22.03 mg/kg，飽和含水量0.56 mL/kg，土壤容重0.87 g/cm，pH 值為7.45.

種子播種于塑料花盆（上下直徑分別為23 cm 和17 cm，高18 cm）內(nèi)，每盆裝入2500 g 土壤，土壤中加入不同質(zhì)量的GO，混勻.根據(jù)土壤中GO 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，共設(shè)置4個(gè)處理組：CK（不添加GO）、0.2%、0.4%和0.6%，每個(gè)處理4 次重復(fù).每盆播種2 g，于室內(nèi)采光良好處進(jìn)行栽培，光照強(qiáng)度600～28000 Lx. 定期適量澆水，使土壤含水量保持在最大持水量的60%，培養(yǎng)期間環(huán)境平均溫度約為25 ℃，空氣相對(duì)濕度為17%～54%.種子萌發(fā)50 d 后測(cè)定相關(guān)指標(biāo).

1.2 指標(biāo)測(cè)定方法

株高和生物量的測(cè)定：選取長(zhǎng)勢(shì)均勻且良好的植株用直尺測(cè)量絕對(duì)株高，5 次測(cè)量取平均值.將收獲的植物地上部莖和葉分開(kāi)，用蒸餾水洗凈并用濾紙吸取水分后，在108 ℃下殺青20 min，再于80 ℃下烘干至恒重后稱(chēng)量.

葉片質(zhì)膜透性的測(cè)定：取葉片剪碎，用10 mL 去離子水作為浸提液浸泡12 h，使用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率R1，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，測(cè)得浸提液電導(dǎo)率R2，計(jì)算電解質(zhì)相對(duì)外滲率[12].

葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定：取葉片剪碎，避光，浸泡于無(wú)水乙醇與丙酮等體積混合液中，使用分光光度計(jì)（UV-1700，日本島津公司）于663、645 和470 nm 處測(cè)量OD 值[13].

MDA 含量和抗氧化酶活性的測(cè)定[14]：MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸氧化法，POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT 活性測(cè)定采用分光光度法，SOD 活性測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey 法在P = 0.05 水平進(jìn)行數(shù)據(jù)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義檢驗(yàn)，采用Origin 軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 GO 添加對(duì)紫花苜蓿株高和地上生物量的影響

土壤中添加不同質(zhì)量的GO 后，紫花苜蓿的生長(zhǎng)情況如圖1 所示.由圖1 可以看出，隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，紫花苜蓿莖、葉生物量和株高均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì).0.2%GO 處理下，紫花苜蓿的莖、葉生物量較對(duì)照組顯著增加（P ＜0.05），株高較對(duì)照組輕微增加，差異不顯著（P ＞0.05）.0.4%和0.6%GO 處理組中，紫花苜蓿的莖、葉生物量和株高均顯著降低，且GO 添加量越大，紫花苜蓿生長(zhǎng)越差，GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)，與對(duì)照組相比，莖、葉生物量分別降低了52.72%和81.96%，株高降低了26.09%.

2.2 GO 添加對(duì)紫花苜蓿葉片質(zhì)膜透性的影響

土壤中添加不同質(zhì)量的GO 后，紫花苜蓿的葉片質(zhì)膜透性如圖2 所示.由圖2 可以看出，隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，質(zhì)膜透性呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì).與對(duì)照組相比，0.2%GO 處理組中紫花苜蓿葉片的質(zhì)膜透性降低了21.30%（P ＜0.05）. 與對(duì)照組相比，0.4%GO 處理組中葉片的質(zhì)膜透性略有增加（P ＞0.05），0.6%GO處理組增加了41.11%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）.

圖1 不同GO 處理組中紫花苜蓿的株高和生物量Fig.1 Plant height and biomass of Medicago sativa in different GO treatment groups

圖2 不同GO 處理組中紫花苜蓿的葉片質(zhì)膜透性Fig.2 Plasma membrane permeability of Medicago sativa leaves in different GO treatment groups

2.3 GO 添加對(duì)紫花苜蓿葉片葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量的影響

不同GO 處理組中，紫花苜蓿的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量如表1 所示.由表1 可以看出，葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量均隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減少.與對(duì)照組相比，0.2%處理組中的葉綠素a 含量略有下降（P ＞0.05），葉綠素b 和總?cè)~綠素含量顯著下降；0.4%和0.6%GO 處理組中，三者均顯著降低.類(lèi)胡蘿卜素含量隨著GO 濃度升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，0.2%GO 處理組中類(lèi)胡蘿卜素含量顯著提高了67.28%，0.4%和0.6%GO 處理組分別降低了21.60%和38.89%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）.

表1 不同GO 處理組中紫花苜蓿葉片的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量Tab.1 Chlorophyll and carotenoid contents of Medicago sativa leaves in different GO treatment groups（mg·g-1）

2.4 GO 添加對(duì)紫花苜蓿丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

不同GO 處理組中，紫花苜蓿的MDA 含量如圖3（a）所示，抗氧化酶活性如圖3（b）—圖3（d）所示.由圖3（a）可以看出，紫花苜蓿葉片和莖中的MDA 含量均隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì).0.2%GO 處理組中，葉和莖的MDA 含量與對(duì)照組相比均顯著下降；0.4%GO 處理組中，葉的MDA 含量與對(duì)照組相比略有增加（P ＞0.05），莖的MDA 含量較對(duì)照組增加了19.76%（P ＜0.05）；0.6%GO 處理組中，葉和莖的MDA 含量與對(duì)照組相比均顯著增加（P ＜0.05）.

由圖3（b）可以看出，葉和莖中的CAT 活性均隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈增加趨勢(shì). 與對(duì)照組相比，3個(gè)GO 處理組中，葉中的CAT 活性均顯著增加，0.6%GO 處理組增加了110.53%；0.2%和0.4%GO 處理組中，莖中的CAT 活性較對(duì)照組略有增加，0.6%GO處理組與對(duì)照組相比增加了34.56%（P ＜0.05）.由圖3（c）和圖3（d）可以看出，紫花苜蓿莖、葉中的SOD 和POD 活性均隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì).0.2%GO 處理組中，葉和莖的SOD 和POD 活性與對(duì)照組相比均顯著下降（P ＜0.05）；0.4%GO 處理組中，葉片的SOD 和POD 活性與對(duì)照組的差異不顯著（P ＞0.05），莖的SOD 和POD 活性均顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）；0.6%GO 處理組中，葉片的SOD 活性顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05），POD 活性與對(duì)照組相比差異不顯著（P ＞0.05），莖的SOD 和POD 活性均顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）.

圖3 不同GO 處理組中紫花苜蓿的MDA 含量和抗氧化酶活性Fig.3 MDA content and antioxidant enzyme activity of Medicago sativa in different GO treatment groups

3 討論與結(jié)論

環(huán)境中的GO 會(huì)在一定程度上影響植物的生長(zhǎng)和生理特征.本研究利用添加不同質(zhì)量GO 的土壤培養(yǎng)豆科植物紫花苜蓿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，紫花苜蓿的生物量和株高均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，表明高濃度GO 對(duì)植株生長(zhǎng)有顯著的抑制作用. 低濃度GO 處理下（0.2%）紫花苜蓿的生物量顯著增加，株高增加不顯著.Chen 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)燕麥在低濃度（0.04 mg/mL）GO 處理下地上部分干重較對(duì)照組增加，而當(dāng)GO 濃度繼續(xù)增加時(shí)燕麥干重顯著減少，這與本研究得到的結(jié)果一致.質(zhì)膜透性是反映細(xì)胞膜透性的重要依據(jù)，通常逆境脅迫程度越高，質(zhì)膜透性越大，表明細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性越差[16].本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度GO 處理下（≥0.4%）紫花苜蓿葉片的質(zhì)膜透性顯著提高，說(shuō)明GO 的添加對(duì)紫花苜蓿構(gòu)成了逆境脅迫，而低濃度GO（0.2%）處理下紫花苜蓿質(zhì)膜透性反而降低.有研究表明，與葉相比，環(huán)境脅迫對(duì)紫花苜蓿根部結(jié)瘤部位造成的細(xì)胞膜破壞更嚴(yán)重，也更難恢復(fù)，從而阻礙了根瘤的生長(zhǎng)[17].因此推測(cè)，GO 脅迫對(duì)紫花苜蓿根部的細(xì)胞膜會(huì)造成嚴(yán)重破壞.

葉綠素是完成光合作用必不可少的組分，與植物生長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系.本研究表明，GO 處理下紫花苜蓿葉綠素含量顯著降低，可能是GO 形成的環(huán)境脅迫抑制了葉綠素的合成.Jokinen 等[18]研究表明，豆科植物的固氮需要很多光合產(chǎn)物.當(dāng)葉綠素含量下降時(shí)，光合作用必然受到影響，豆科植物的固氮效率也會(huì)下降.GO 對(duì)植物的影響因GO 濃度、植物與GO 的接觸時(shí)間、植物自身種類(lèi)不同而有差異[19].王鑫禹等[20]的研究表明，高羊茅培養(yǎng)到50 d 時(shí)基質(zhì)中添加1%的GO，與對(duì)照相比株高增加了4.03%，葉綠素a、b 含量無(wú)顯著變化.而紫花苜蓿在GO 添加超過(guò)0.4%時(shí)就表現(xiàn)出明顯的脅迫反應(yīng)，株高和葉綠素含量均顯著下降.由此可知，與禾本科植物高羊茅相比，紫花苜蓿對(duì)GO 添加更敏感.

植物在逆境脅迫下，細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧增加，抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)提高CAT、POD、SOD 等酶的活性，其中，SOD 可以催化超氧自由基反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，POD 和CAT 可以催化H2O2反應(yīng)，以此來(lái)消耗過(guò)量的活性氧，減輕活性氧帶來(lái)的脅迫[21].本研究結(jié)果表明，高濃度GO處理下，紫花苜蓿的CAT、POD、SOD 活性均有顯著提高，這是因?yàn)楦邼舛菺O 對(duì)紫花苜蓿造成了脅迫，使紫花苜蓿的抗氧化防御系統(tǒng)提高相關(guān)酶的活性.而低濃度GO 對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，所以0.2%GO處理下POD、SOD 含量較對(duì)照組都有所降低.MDA 是反映膜脂過(guò)氧化程度的指標(biāo)，其含量的增加會(huì)加劇膜損傷.本研究中，在高濃度GO 處理組中紫花苜蓿的MDA 含量較對(duì)照組顯著增加，說(shuō)明此時(shí)紫花苜蓿受到脅迫，而低濃度GO 處理組中MDA 含量較對(duì)照組減少，是因?yàn)榈蜐舛认翯O 對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用，這與保護(hù)酶活性以及葉片質(zhì)膜透性的變化趨勢(shì)一致.Chen 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，GO 對(duì)水培和土培的裸燕麥均造成了氧化脅迫，CAT 和MDA 含量隨GO 濃度增加而提高.在紫花苜蓿的環(huán)境脅迫研究中，Salah 等[17]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響與電解質(zhì)泄漏有關(guān)，鹽脅迫使葉片電解質(zhì)泄露增加6 倍，使結(jié)瘤部位電解質(zhì)泄露增加5 倍，而且鹽脅迫會(huì)使根部結(jié)瘤處和葉片的SOD 酶活性增加.因此，本研究推測(cè)GO 可能是通過(guò)改變細(xì)胞質(zhì)膜透性對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)生脅迫作用.

綜上所述，GO 處理對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)和生理生態(tài)特征有顯著影響，較低濃度的GO 處理就可能會(huì)使紫花苜蓿受到嚴(yán)重脅迫.GO 添加到土壤后，降低了紫花苜蓿的葉綠素含量，抑制了光合作用，不利于其生長(zhǎng)，而且隨GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加抑制作用增強(qiáng)，SOD、POD 和CAT 活性升高，MDA 含量也會(huì)增加.基于這些結(jié)果，本課題組將進(jìn)一步探究GO 對(duì)苜蓿等豆科植物結(jié)瘤及固氮機(jī)制等方面的影響.