高鹽誘導(dǎo)左心室舒張功能障礙大鼠心肌Zip13表達增高

滕天明，黃進勇，薛雨辰，黃龍飛，楊 清，孫躍民

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，天津 300052)

近年來射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭(heart failure with preserved left ventricular ejection fraction, HFpEF)的患病率在逐漸增加，年死亡率約為22.2%，其發(fā)病機制仍不明確，目前尚無有效的治療方案能夠完全逆轉(zhuǎn)HFpEF的自然病程[1]。目前有研究認(rèn)為，左心室舒張功能障礙(LVDD)引發(fā)的心肌細(xì)胞內(nèi)一系列病理生理改變可能是HFpEF細(xì)胞內(nèi)源性發(fā)病機制之一。大量研究表明鋅(Zinc，Zn)及鋅轉(zhuǎn)運體(Zinc transporter)與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，鋅轉(zhuǎn)運體包含ZnT和Zip兩大家族，目前已經(jīng)確定了10種ZnT和14種Zip鋅轉(zhuǎn)運體。本課題組前期研究中不僅發(fā)現(xiàn)鋅轉(zhuǎn)運體Zip2在心肌缺血再灌注小鼠心肌中表達明顯上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)STAT3發(fā)揮心肌保護作用[2]，而且還發(fā)現(xiàn)HEpEF大鼠心肌組織中Zip 14的mRNA和蛋白表達水平亦明顯增高。目前尚無研究報道Zip13在LVDD心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的病理生理學(xué)作用，因此本文擬采用Dah1鹽敏感大鼠制備LVDD模型，探討鋅轉(zhuǎn)運體Zip13在LVDD大鼠心肌組織的表達變化及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 Dah1鹽敏感性大鼠(Dah1 salt-sensitive rat，DSS)，雄性，5周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。大鼠在環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度45%～55%，12 h/12 h光照周期，SPF屏障環(huán)境飼養(yǎng)盒內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2主要試劑和儀器 Zip13兔多克隆抗體(BIORBYT, UK)，GAPDH抗體(Cell Signaling Technology，America)，HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗(Sigma，America)?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測試劑盒(Millipore，America)；總RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(Invitrogen，America)。所用引物均由美國Invitrogen公司合成。其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器包括CFX 96 Real-Time system(Bio-Rad，America)，電感耦合等離子光譜儀(ICP，PerKinElmer，America)，小動物超聲儀(Vevo 2100 Imaging System，Canada)，尾套式智能無創(chuàng)血壓儀(BP-2010 AUL Softron，Japan)等。

1.3主要方法

1.3.1動物模型的制備及標(biāo)本采集 將36只DSS大鼠隨機分為模型組(n=22)和對照組(n=14)。模型組和對照組飼料中氯化鈉含量分別為8%和0.3%，其他組分含量完全相同(鋅的含量均為30 mg/kg)。造模期內(nèi)，每日記錄體重、呼吸頻度、毛色、反應(yīng)和活動度等體征變化；每兩周使用尾套式智能無創(chuàng)血壓儀測量并記錄心率和血壓；分別于造模后第6周、12周和19周，采用小動物超聲儀檢測大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)：室間隔舒張末期厚度(IVSd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、舒張末左心室后壁厚度(LVPWd)、收縮末左心室后壁厚度(LVPWs)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室質(zhì)量(LVM)、Weight和LVM/Weight。經(jīng)各項指標(biāo)證實模型制備成功后，收集各組大鼠血清，分離出左心室分裝后儲存于-80℃冰箱，用于提取蛋白、RNA及檢測Zn離子濃度。

1.3.2實時定量熒光PCR(RT-qPCR)檢測大鼠心肌組織Zip13 mRNA表達 Trizol法提取心肌組織總RNA。NanoDrop 2000 C 分光光度法測定總RNA濃度，經(jīng)RNA甲醛變性電泳檢測其完整性，然后行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照Real-Time PCR試劑盒說明書的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟行PCR，GAPDH作為內(nèi)參照，擴增條件為95 ℃ 1 min，(95 ℃ 15 s、Tx ℃ 30 s、72 ℃ 15 s)35個循環(huán)，72 ℃ 1 min。引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件設(shè)計，經(jīng)Blast進行同源性比較，由Invitrogen公司合成(表1)，運用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

表1 實時定量RT-PCR引物序列

1.3.3Western Blot法檢測大鼠心肌組織Zip13蛋白的表達 用RIPA提取各組大鼠心肌組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取30 μg蛋白樣品，加入2×上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶溶液室溫封閉90 min后，Zip 13抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，每次10 min，孵兔抗大鼠二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌4 次，每次15 min，ECL顯影，GAPDH為內(nèi)參，使用Image Lab軟件對其進行數(shù)據(jù)分析處理。

1.3.4電感耦合等離子發(fā)射光譜法(ICP-OES)測定鋅離子濃度 65%的濃硝酸進行心肌組織消解，配置標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度需達到0.9999以上，各組大鼠血清500 μl及1 ml超純水加入到2 ml EP管中，使用電感耦合等離子光譜儀檢測并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5超聲心動圖檢查 采用Vevo 2100 Imaging System小動物超聲儀MS400探頭(探頭頻率為30 MHz)行超聲心動圖檢查，全部操作由培訓(xùn)的專業(yè)人員按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成。分別在第6周、12周和19周，將兩組大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，胸前備皮、仰臥位固定，B-Mode獲取左心室長軸切面，M型超聲取樣線置于乳頭肌處，垂直于室間隔及左心室后壁，經(jīng)M型超聲曲線測量。獲取指標(biāo)主要包括： IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVIDd和LVIDs。計算LVEF、LVM和LVM/Weight。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠基本情況 造模過程中，模型組共有5只大鼠死亡，對照組無死亡。與對照組比較，第19周時，經(jīng)兩名臨床醫(yī)師獨立判定，模型組大鼠大部分表現(xiàn)為豎毛且毛色光澤度差，活動度下降，經(jīng)常性閉目、反應(yīng)不敏感，個別還出現(xiàn)呼吸頻度明顯加快等表現(xiàn)。

2.2兩組大鼠血壓、心率的變化 與對照組相比，模型組平均收縮壓和舒張壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而平均心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同時間點間的平均收縮壓、舒張壓和心率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；時間與處理因素的交互作用下平均收縮壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而平均舒張壓和心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)血壓升高，尤其收縮壓升高明顯，見表2。

表2 兩組大鼠血壓和心率比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.3兩組大鼠超聲心動指標(biāo)的變化 第6周時，模型組大鼠的LVDd、LVDs、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVM、Weight及LVM/Weight差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第12周時，模型組大鼠LVPWs、Weight及LVM/Weight明顯增高(P<0.05)；第19周時，模型組大鼠LVDd、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVM及LVM/Weight明顯增高(P<0.05)，而Weight明顯降低(P<0.05)，LVDs及LVEF差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組和對照組大鼠第19周的LVDd、LVDs、IVSd、LVPWd、LVPWs、LVM、和Weight值均高于第6周，而LVM/Weight和LVEF均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。時間與處理因素的交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明第12周時，模型組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯不對稱室壁增厚，尤其是LVPWd、LVPWs和LVM/Weight明顯升高，進行性左心室舒張功能不全和心肌肥厚的征象已經(jīng)開始顯現(xiàn)。到第19周時，伴隨模型組大鼠普遍意義的心肌尺徑增厚，開始呈現(xiàn)收縮功能正常而舒張功能受損，左心室重構(gòu)性肥厚明顯，即出現(xiàn)明顯的LVDD超聲表現(xiàn)。見圖1。

2.4兩組大鼠血清和心肌組織中鋅離子濃度濃度的變化 ICP-OES檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織中的鋅含量顯著增加，而血清中鋅離子濃度則明顯降低，見圖2。

2.5兩組大鼠心肌組織中Zip13 mRNA和蛋白的表達變化 與對照組相比，模型組心肌組織Zip13 mRNA的表達水平明顯增高，而且與其對應(yīng)的Zip13蛋白表達水平亦顯著升高(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

近年來，細(xì)胞和分子水平的探索成為心力衰竭研究領(lǐng)域的熱點[3]。鋅維持細(xì)胞正常生理功能及發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的前提是鋅穩(wěn)態(tài)[4]。鋅穩(wěn)態(tài)是指鋅在機體內(nèi)的濃度和分布處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡，該動態(tài)平衡被打破即鋅穩(wěn)態(tài)失衡。鋅穩(wěn)態(tài)失衡與多種心血管疾病包括缺血再灌注損傷有關(guān)[5]。鋅的動態(tài)活性及其作為信號傳遞介質(zhì)的作用是目前研究的熱點。盡管鋅離子本身具有氧化還原惰性，但是其對氧化還原狀態(tài)的變化很敏感[6]。有研究顯示，機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，鋅會從細(xì)胞內(nèi)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等結(jié)合位點加速釋放，有可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鋅富集。這種鋅聚集有可能潛在影響線粒體代謝，從而反饋性影響細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。這些作用有可能是通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的[7]。

我們推測本研究觀察到的鋅胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的原因之一是心肌需鋅量增加，這很可能涉及和包括一些研究者定義的細(xì)胞內(nèi)早期和晚期鋅信號。早期鋅信號快速且短暫，沒有鋅轉(zhuǎn)運體的參與，不會對細(xì)胞內(nèi)鋅的濃度和分布造成本質(zhì)改變即基本不會改變鋅穩(wěn)態(tài)[8]。晚期鋅信號的作用則緩慢且持久，持續(xù)超過數(shù)小時的鋅刺激才有可能引起細(xì)胞內(nèi)鋅濃度和分布的絕對變化，且主要是需要能量和復(fù)雜啟動機制的鋅轉(zhuǎn)運體協(xié)助下鋅的跨膜主動轉(zhuǎn)運引起的，通常對細(xì)胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)起決定作用[9]。本研究推測，LVDD心肌細(xì)胞內(nèi)鋅濃度可能先后經(jīng)歷了以上兩個過程，且鋅轉(zhuǎn)運體Zip13可能參與了一系列復(fù)雜晚期鋅信號的調(diào)控。

本研究中，兩組大鼠均為正常鋅飲食，飼料中鋅的含量均為30 mg/kg。在沒有額外的外源性鋅攝取和補充的情況下，推測LVDD大鼠心肌細(xì)胞鋅濃度升高的原因很有可能是某種機制促使細(xì)胞從血漿中以一定途徑向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入了更多的鋅。但也有研究認(rèn)為，可能是機體外排鋅的增加導(dǎo)致了細(xì)胞外鋅濃度降低[10]。本研究認(rèn)為尚不能完全確定LVDD大鼠血清中鋅離子轉(zhuǎn)移的方向，但我們的發(fā)現(xiàn)與以上兩種觀點并不矛盾。因為啟動和調(diào)控機制的不同，以上關(guān)于鋅轉(zhuǎn)移的方向和途徑很有可能是同時存在的。

以往研究顯示，Zip13所屬的Zip家族的作用是主動將細(xì)胞器或細(xì)胞外的鋅離子向胞內(nèi)釋放或轉(zhuǎn)運以增加細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度[11]。我們推測，LVDD心肌細(xì)胞處于壓力誘發(fā)的應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)存在鋅穩(wěn)態(tài)失衡，通過某種途調(diào)控鋅離子由心肌細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)的晚期鋅信號發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激、抗炎的心肌保護作用，Zip13很可能參與了該過程并發(fā)揮了重要的載體和媒介作用[12-13]。Zip13與鋅濃度升高即穩(wěn)態(tài)失衡二者之間明確的因果關(guān)系和相互作用還存在很大爭議，有待進一步闡明。STAT3信號通路和核因子(NF)-κB信號通路可能與具體的作用機制有關(guān)[14-15]。截至目前，至少有兩種觀點是存在的。第一種觀點認(rèn)為鋅本身作為一種信號分子，心肌鋅濃度的改變作為原因在先，Zip13感受鋅信號后被動調(diào)控鋅濃度[16-18]。第二種觀點則認(rèn)為Zip13表達增加可能是LVDD心肌病生理改變的適應(yīng)性變化，即心肌細(xì)胞自身適應(yīng)性調(diào)整。甚至有研究者認(rèn)為，鋅可能與Zip13無直接關(guān)系，即使二者有關(guān)，鋅也并不是唯一導(dǎo)致Zip13表達增加的始動因素[19-22]。本研究結(jié)果更傾向于第一種觀點。

本研究有一定局限性，從以下幾個方面改進和完善是必要的：首先，增加外源性鋅干預(yù)，如不同濃度梯度的外源性補鋅和缺鋅干預(yù)，以確證鋅的作用；其次，增加對機體不同組織或細(xì)胞不同區(qū)域鋅分布的檢測，特別是增加機體外排鋅的檢測；最后，增加對Zip13本身的直接干預(yù)包括基因敲除等手段等，以明確鋅與Zip13的相互關(guān)系和具體調(diào)控機制。同時，有必要將其他鋅轉(zhuǎn)運體一并納入研究和篩選范圍。通過以上改進和完善，以期明確LVDD中鋅與Zip13的具體作用機制。