河蟹土池生態(tài)育苗敞池培養(yǎng)褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis的技術(shù)

邵力　肖佳華　宋小平　閔元棋　楊家新

摘要：土池生態(tài)育苗是目前江蘇沿海河蟹育苗的主導(dǎo)模式。通過敞水池塘開放式培養(yǎng)天然餌料（微藻-輪蟲）達(dá)到生產(chǎn)河蟹苗種的目的。敞池培養(yǎng)海水褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）即在生物餌料培育過程中，通過添加培育天然餌料微藻和補(bǔ)充外源性餌料按照一定配比提高輪蟲生產(chǎn)密度，延長輪蟲高峰期持續(xù)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)河蟹“餌料微藻-輪蟲-河蟹幼苗”的土池生態(tài)育苗良性生產(chǎn)。通過在露天培育土池中，加入經(jīng)過發(fā)酵的酵母懸液和無機(jī)氮肥（尿素）溶解液的方式，使輪蟲的高峰期（>1 200 ind./mL）時(shí)間維持5～6 d，最大密度達(dá)到3 320±35.78 ind./mL，比對照池最大密度（1 023±53.30 ind./mL）高出近2倍，由此可見，酵母加無機(jī)肥培養(yǎng)生物餌料的方式能相對縮短褶皺臂尾輪蟲達(dá)到峰值的時(shí)間，并能明顯提高種群的密度和延長輪蟲高峰期時(shí)間。

關(guān)鍵詞：河蟹;育苗;微藻;褶皺臂尾輪蟲;酵母;尿素;密度

中圖分類號： S963.21+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0198-05

褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）多數(shù)分布在鹽度較高的河口和近海區(qū)域，具有適應(yīng)力強(qiáng)、生長快、游動緩慢等特點(diǎn)，適合大規(guī)模人工培養(yǎng)作為水產(chǎn)動物的開口生物餌料。由于輪蟲在水體中分散性好、營養(yǎng)價(jià)值高、無殘餌污染，能顯著提高育苗成活率和改善苗種品質(zhì)，褶皺臂尾輪蟲是海產(chǎn)動物育苗不可或缺的開口餌料之一[1-2]。

江蘇是我國中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）育苗和養(yǎng)殖大省，大眼幼體產(chǎn)量占全國年總產(chǎn)量的60%以上[3]。中華絨螯蟹人工育苗技術(shù)的突破始于土池育苗，20世紀(jì)90年代中后期，以贛榆模式為代表的集約化育苗占據(jù)主導(dǎo)地位[4]，但缺乏成熟的生物餌料生產(chǎn)技術(shù)作為保障，受多種因素影響，集約化育苗模式重新被土池生態(tài)育苗技術(shù)所替代。生物餌料（輪蟲）的生產(chǎn)技術(shù)仍然是河蟹土池生態(tài)育苗的共性關(guān)鍵技術(shù)難題。主要表現(xiàn)如下：

（1）池塘資源占用過大。江蘇省是我國河蟹苗種的主要產(chǎn)區(qū)之一，土池生態(tài)育苗規(guī)模穩(wěn)定在2 000～2 600 hm2左右，生產(chǎn)上一般需按面積比2 ∶1配置生物餌料池（主要是輪蟲餌料池），其中用于生物餌料的池塘約1 300～2 000 hm2。

（2）粗放生產(chǎn)，產(chǎn)量波動大。河蟹土池育苗是利用灘涂土池露天生產(chǎn)大眼幼體。餌料微藻來源于天然海水自帶的藻類，輪蟲主要來源于土池底泥沉積物中的休眠卵自然萌發(fā)，因此，生產(chǎn)過程無固定的優(yōu)勢種（餌料微藻）。目前，絕大部分企業(yè)均采用較為粗放的靠天收模式生產(chǎn)生物餌料[5]。這種模式的缺點(diǎn)在于：餌料池輪蟲進(jìn)入高峰期后一次采收，之后輪蟲種群無法再次進(jìn)入高峰期，育苗期間，對生物餌料大量需求的時(shí)間段集中在10～20 d，具有較強(qiáng)的時(shí)效性。因此，盡管已經(jīng)配置了專門餌料生產(chǎn)池，粗放式生產(chǎn)提供的生物餌料依然難以滿足生產(chǎn)所需。

（3）潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)突顯。目前，使用發(fā)酵雞糞作為基肥，利用海水天然餌料微藻生產(chǎn)輪蟲是育苗企業(yè)最常見的生產(chǎn)模式[6]。該模式最大的問題是雞糞攜帶的病原菌加入育苗水體以及畜禽養(yǎng)殖中抗生素的藥物殘留可能會通過食物鏈傳遞至蟹苗，給河蟹育苗甚至整個(gè)河蟹產(chǎn)業(yè)帶來巨大的潛在風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，餌料池的尾（廢）水的排放與目前環(huán)境優(yōu)先的政策相悖。

因此，針對江蘇河蟹土池生態(tài)育苗中共性關(guān)鍵技術(shù)，筆者于2018年4—5月在江蘇省射陽縣蟹苗養(yǎng)殖基地試驗(yàn)初探并取得初步成果，現(xiàn)將試驗(yàn)的主要技術(shù)要點(diǎn)和過程總結(jié)如下。

1 池塘條件

2口池塘分別作為對照池和試驗(yàn)池，塘口均位于射陽東海海岸線，旁呈東西走向，水量充沛可靠，水質(zhì)清新且無農(nóng)藥等污染源。土為黏性土壤。池塘呈鍋底形，平均深度2 m，水深最深處達(dá)3 m，每口池塘的面積約1 hm2。

1.1 基肥

先對池塘進(jìn)行清塘處理，方法為使用漂白粉30～50 g/m3，攪拌底泥，暴露于漂白粉環(huán)境處理3 d;待消毒處理結(jié)束后引進(jìn)新鮮過濾海水，海水經(jīng)過雞糞堆積口注入池塘，雞糞作為基肥一同注入輪蟲池進(jìn)行肥水，雞糞使用量為60 m3/hm2;之后，分別在對照池和試驗(yàn)池中接入等量的海水小球藻培養(yǎng)。

1.2 輪蟲接種

鏡檢，待藻類密度達(dá)到約1×106 ind./mL時(shí)，分別在對照池和試驗(yàn)池中接入褶皺臂尾輪蟲，接種密度約400 ind./mL。

1.3 培養(yǎng)管理

試驗(yàn)池培育過程使用尿素（主要成分為碳酰胺，江蘇晉煤恒盛化工股份有限公司生產(chǎn)）作為追肥肥料，并補(bǔ)充活化處理的酵母懸液（安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)）。

培養(yǎng)期間，根據(jù)池塘浮游生物變化特點(diǎn)，使用尿素追肥1次，尿素使用量為90 kg/hm2左右，溶解后全池潑灑。之后，為防止餌料微藻不足，利用活化酵母補(bǔ)充，酵母用量60 kg/hm2左右，酵母活化按質(zhì)量比100 ∶10 ∶1的比例添加水、酵母和紅糖，激活10 h，搖勻，靜置后取上清液潑灑，全池潑灑。在試驗(yàn)期間未施用其他肥料，通常不換水，2個(gè)池塘不相通。

2 樣本采集與數(shù)據(jù)分析

采樣時(shí)間為每天08：00，在池塘四角和中間設(shè)置采水點(diǎn)，使用YSI水質(zhì)分析儀現(xiàn)場測定理化因子。用13號和25號浮游生物網(wǎng)采集浮游植物和輪蟲進(jìn)行定性定量分析，每個(gè)采水點(diǎn)采集的10 L水樣過濾濃縮至50 mL，用福爾馬林溶液固定并帶回室內(nèi)鏡檢，檢測方法參照《淡水浮游生物研究方法》[7]，試驗(yàn)周期為8 d。

采用SPSS 16.0中的單因素方差（one-way ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行多重比較，同時(shí)采用SigmaPlot 10作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶氧量、鹽度、電導(dǎo)率變化

3.1.1 溶氧量變化

試驗(yàn)期間，對照池和試驗(yàn)池的溶氧量變化趨勢基本一致，分別在培養(yǎng)3、1 d達(dá)到峰值[（12.90±0.42） mg/L 和（12.09±0.38） mg/L]，但試驗(yàn)池溶解氧明顯低于對照池。高峰期過后從培養(yǎng)6 d 開始試驗(yàn)池的溶氧量高于對照池（圖1）。

3.1.2 鹽度變化

如圖2所示，對照池和試驗(yàn)池鹽度差異明顯，除培養(yǎng)7 d時(shí)對照池高于試驗(yàn)池外，其他時(shí)間對照池均低于試驗(yàn)池。對照池和試驗(yàn)池分別在培養(yǎng)7、8 d達(dá)到最大值[（24.41±0.38）‰和（25.31±0.59）‰]，試驗(yàn)池的鹽度在試驗(yàn)時(shí)間較對照組變化更為穩(wěn)定。

3.1.3 電導(dǎo)率變化

試驗(yàn)池前6 d的電導(dǎo)率均高于對照池，且2組之間差異明顯。對照池電導(dǎo)率3 d達(dá)到最高值33.11±0.63 mS/cm，試驗(yàn)池4 d達(dá)到最高值39.53±0.28 mS/cm，對照池僅在培養(yǎng)7 d時(shí)電導(dǎo)率高于試驗(yàn)池（圖3）。

3.2 微藻種類組成

在試驗(yàn)的8 d時(shí)間內(nèi)，共檢測到常見藻類21種，添加尿素和酵母的試驗(yàn)池的微藻不同種類出現(xiàn)的頻率明顯多于對照池。培養(yǎng)8 d時(shí)對照池和試驗(yàn)池的藻類種類數(shù)量達(dá)到最大值，對照池11種、試驗(yàn)池18種，藻類組成均以綠藻門為主，硅藻門次之。微藻種類出現(xiàn)頻率如表1所示。

3.3 浮游植物生物量和葉綠素含量動態(tài)變化

如圖4所示，2池浮游植物生物量的變化趨勢基本一致。對照池和試驗(yàn)池培養(yǎng)3 d浮游植物生物量均達(dá)到最大值[（9.27±0.43） g/L和（10.33±0.51） g/L]，且試驗(yàn)池植物生物量遠(yuǎn)高于對照池。2池在前2 d生物量增長速度最快，且試驗(yàn)池明顯快于對照池。2池分別在6 d生物量驟然下降至（2.06±0.33） g/L和（1.16±0.46） g/L。

試驗(yàn)池的葉綠素含量在增速和峰值上明顯高于對照池，對照池和試驗(yàn)池分別在培養(yǎng)2、3 d達(dá)到葉綠素含量的峰值[（187.1±9.36） g/L 和（209.56±4.10） g/L]。在培養(yǎng)6～8 d，2池的葉綠素變化趨勢與浮游植物生物量變化趨勢密切相關(guān)（圖5）。

3.4 輪蟲密度

由圖6可以看出，接種后，到培養(yǎng)6 d，輪蟲密度呈現(xiàn)指數(shù)增長，且試驗(yàn)池培養(yǎng)6 d達(dá)到高峰期[（3 320±35.78） ind./mL]。對照池滯后，在培養(yǎng)7 d達(dá)到峰值（1 023±53.30） ind./mL，試驗(yàn)池輪蟲高峰期早于對照池，密度明顯高于對照池。在試驗(yàn)的8 d時(shí)間內(nèi)，試驗(yàn)組輪蟲在培養(yǎng)4 d開始出現(xiàn)爆發(fā)性增長，之后的4 d內(nèi)，輪蟲密度均明顯高于對照池，且密度維持在1 000 ind./mL以上，持續(xù)時(shí)間達(dá)5 d，對照組整個(gè)試驗(yàn)期間密度維持在1 023 ind./mL 以下。

4 討論與結(jié)論

4.1 尿素和發(fā)酵酵母添加對水質(zhì)及微藻種類的影響

在河蟹育苗過程中，微藻不僅可以作為河蟹早期幼體和輪蟲的食物，而且對調(diào)節(jié)水質(zhì)也具有重要作用，微藻的種類和密度常是河蟹育苗成功與否的關(guān)鍵[8]。本研究表明：輪蟲培養(yǎng)期間，在原有基肥基礎(chǔ)上，添加尿素作為追肥，利用活化酵母作為輪蟲餌料補(bǔ)充時(shí)，會對水體理化因子產(chǎn)生一定影響。通過浮游植物生物量和葉綠素含量分析可以得出，添加尿素追肥可促進(jìn)土池中藻類的生長。同時(shí)，通過藻類組成變化可以看出，微藻種類以及優(yōu)勢種亦隨添加無機(jī)肥和酵母而發(fā)生改變，試驗(yàn)池培養(yǎng)5～8 d微藻的種類明顯多于對照組，可能是因?yàn)榈歉∮沃参锛?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)的重要組成成分，尿素的添加可以補(bǔ)充氮元素，從而引起微藻生長特性和生化組成的變化。有研究表明，藻類能利用各種形態(tài)的氮，如硝酸鹽、銨鹽、尿素[9-12]，但以尿素為氮源最好，硝酸鈉次之，氯化銨較差[13]。桑敏等的研究證明，適當(dāng)增加氮的濃度可以促進(jìn)微藻的生長，提高微藻產(chǎn)量[14]。磷則作為底物或調(diào)節(jié)物直接參與植物光合作用[15]。張青田等研究了尿素對幾種海洋微藻生長的影響情況，結(jié)果表明，尿素對球藻、硅藻等微藻的生長影響極顯著，但最適生長的濃度值均不同;同時(shí)他們還對N/P值的情況進(jìn)行了探討，提出該比值可能和氮態(tài)有關(guān)[16]。這些研究都表明，尿素的添加會產(chǎn)生一系列的影響，這些影響包括理化因子的變化及其導(dǎo)致的池內(nèi)微藻種類和優(yōu)勢種的變化。

本研究結(jié)果顯示，在輪蟲池內(nèi)添加適量的尿素能增加微藻種類多樣性，適宜性微藻能促進(jìn)輪蟲的生長繁殖，因此建議在輪蟲生產(chǎn)中可以添加適量的尿素。

4.2 尿素和發(fā)酵酵母添加對輪蟲密度的影響

生物餌料的質(zhì)量是決定河蟹溞狀幼體成活率和生長發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。褶皺臂尾輪蟲是海水魚類和蝦蟹育苗的重要生物餌料，吳學(xué)軍等認(rèn)為，由于褶皺臂尾輪蟲自身不能合成不飽和脂肪酸，通過酵母可以進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化，而強(qiáng)化的輪蟲投喂的溞狀幼體在Z5-M階段的成活率也會更高[17]。

有關(guān)酵母對輪蟲生長的促進(jìn)作用也已有相當(dāng)多的研究，Ricci等的研究表明：在活藻喂食試驗(yàn)中，微藻能促進(jìn)輪蟲的成熟和產(chǎn)卵，而酵母飼料能有限維持輪蟲的繁殖狀態(tài)下及生長;酵母喂食試驗(yàn)中，他們證實(shí)除了微藻類，輪蟲的食物也可考慮酵母，但單獨(dú)喂養(yǎng)酵母會導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏，而以1 ∶1的方式提供酵母和擬微綠球藻可以使得輪蟲的生長速率與全部投喂擬微綠球藻的生長速率基本相同，在沒有足夠的藻類喂養(yǎng)輪蟲時(shí)，酵母是有效的輪蟲食物替代物[18]。王金秋等的研究也表明酵母和藻類搭配投喂對萼花臂尾輪蟲種群的增長速度有較大幅度的提高[19-21]，在褶皺臂尾輪蟲中也有相似的表現(xiàn)[22-24]。在本研究中，添加尿素和酵母的試驗(yàn)池的輪蟲數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照池，由此證明：發(fā)酵的酵母對輪蟲種群密度的增長有明顯的促進(jìn)作用且輪蟲的高峰期（>1 200 ind./mL）可維持5～6 d，最大密度可達(dá)到（3 320±35.78） ind./mL，比對照池最大密度[（1 023±53.30） ind./mL]高出近2倍。

值得關(guān)注的是本試驗(yàn)的3個(gè)理化因子（溶氧量、鹽度和電導(dǎo)率）。對照池的溶氧量高于試驗(yàn)池，可能是由于試驗(yàn)池輪蟲密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照池，大量的輪蟲需要更多的氧氣進(jìn)行呼吸作用從而導(dǎo)致溶氧量值較低。在鹽度方面，徐海龍等認(rèn)為，鹽度在30‰左右時(shí)，褶皺臂尾輪蟲的種群密度和增殖率最大，鹽度超過30‰時(shí)，褶皺臂尾輪蟲和總種群密度呈下降趨勢，而處于15‰～30‰時(shí)，輪蟲密度也隨鹽度的升高而升高[25-27]。在本試驗(yàn)中，由于添加了無機(jī)肥尿素和酵母，鹽度值明顯增高，且明顯高于對照池（鹽度低于30‰），輪蟲種群密度相應(yīng)增大，試驗(yàn)池輪蟲密度遠(yuǎn)高于對照池，二者呈正相關(guān)關(guān)系，這與之前的研究成果一致。電導(dǎo)率能反映水體整體的營養(yǎng)水平，雞糞、尿素和酵母的添加使水體整體呈富營養(yǎng)化特征，水電導(dǎo)率處于較高水平。王魏根等人認(rèn)為，在水體整體穩(wěn)定的情況下，高電導(dǎo)率說明營養(yǎng)鹽多，有利于水體浮游生物的繁殖，輪蟲的密度也會增加[28-31]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)池的電導(dǎo)率明顯高于對照池，輪蟲密度也明顯高于對照池，與之前的研究結(jié)果一致。

因此，本研究的結(jié)果顯示，在露天池塘培育輪蟲時(shí)，在原有基肥基礎(chǔ)上，添加尿素作為追肥，利用發(fā)酵酵母作為輪蟲餌料補(bǔ)充的方式能相對縮短褶皺臂尾輪蟲達(dá)到峰值的時(shí)間，并能明顯提高種群密度和延長高峰期時(shí)間。

綜合比較對照池和試驗(yàn)輪蟲池的各種理化因子、微藻種類動態(tài)變化、輪蟲密度等，筆者認(rèn)為：發(fā)酵酵母結(jié)合無機(jī)肥（尿素）培養(yǎng)生物餌料的方式能夠調(diào)節(jié)水質(zhì)，促進(jìn)微藻種類多樣化和輪蟲的生長，能夠有效維持輪蟲的高峰期且降低環(huán)境負(fù)荷，符合當(dāng)期集約化生產(chǎn)和河蟹育苗的需要和未來發(fā)展的趨勢。

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