玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)和繼代研究

李海霞　謝久鳳　孫金花

摘要：以玉米自交系87-1、鄭22、齊319、昌7-2和雜交種齊319×HiⅡA、齊319×87-1、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA等的幼胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，研究了玉米不同基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和繼代的影響。結(jié)果表明，不同基因型的胚性愈傷誘導(dǎo)率、繼代能力有著顯著差異。鄭22×87-1胚性愈傷誘導(dǎo)率為83.86%，而昌7-2×HiⅡA胚性愈傷誘導(dǎo)率為41.15%，相差很多。但在繼代能力上由于昌7-2×HiⅡA高度松散，具有明顯的顆粒狀，其繼代擴(kuò)繁能力明顯高于鄭22×87-1，這說(shuō)明胚性愈傷誘導(dǎo)率和繼代繁殖能力之間沒(méi)有必然的聯(lián)系，昌7-2×HiⅡA繁殖能力強(qiáng)，是最好的組培材料。自交系中只有87-1誘導(dǎo)出較好的Ⅱ型愈傷組織，但誘導(dǎo)率比較低。剛誘導(dǎo)出的愈傷組織比較堅(jiān)硬，經(jīng)過(guò)3～4次繼代后，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，色澤鮮亮，增殖快，是進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的最好時(shí)期。

關(guān)鍵詞：玉米;基因型;胚性愈傷組織;誘導(dǎo)率;繼代

中圖分類號(hào)： S513.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）07-0074-04

玉米幼胚是目前基因工程使用較多的外植體，已有報(bào)道可用新鮮的幼胚（IE）[1-2]或由幼胚誘導(dǎo)形成的Ⅰ型[3]和Ⅱ型[4]愈傷組織作為玉米轉(zhuǎn)基因的受體材料?；蛐蛯?duì)玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)影響很大。雜種誘導(dǎo)能力明顯強(qiáng)于自交系[5]，盡管就創(chuàng)造、篩選突變體和基因轉(zhuǎn)化的快速應(yīng)用而言，利用自交系具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是玉米組織培養(yǎng)的研究多數(shù)選用雜交種作為試驗(yàn)材料。植株再生頻率直接決定于愈傷組織的類型，繼代過(guò)程中胚性愈傷組織的頻率與植株再生率有著直接的聯(lián)系。而雜交種的愈傷組織在繼代過(guò)程中胚性不容易喪失，而且再生頻率高，對(duì)于植物的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

優(yōu)良的愈傷組織關(guān)系到培養(yǎng)體系的長(zhǎng)期培養(yǎng)能力和植株的再生能力，是玉米高效組織培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)。愈傷組織的劃分一般參照Amstrong等的標(biāo)準(zhǔn)[6]：具有再生能力的愈傷組織根據(jù)生長(zhǎng)狀況和再生途徑分為2類，即Ⅰ型愈傷組織和Ⅱ型愈傷組織。Ⅰ型愈傷組織白色塊狀、堅(jiān)硬、干燥、結(jié)構(gòu)緊密，難以長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，主要通過(guò)器官發(fā)生途徑再生植株;Ⅱ型愈傷組織乳白色或淺黃色、結(jié)構(gòu)松散易碎、呈顆粒狀、易產(chǎn)生胚狀體，適合長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，主要通過(guò)胚狀體途徑再生植株，是理想組織培養(yǎng)材料。后來(lái)根據(jù)不同試驗(yàn)者的觀察又把結(jié)構(gòu)松軟、白色透明或半透明，水漬狀，不容易繼代培養(yǎng)，且喪失了分化能力，不能再生成苗的愈傷組織劃分為Ⅲ型[7-9]。愈傷組織的誘導(dǎo)率受基因型、激素、培養(yǎng)條件等許多因素的影響，其中基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響更為明顯，不同基因型的繼代能力及繁殖能力區(qū)別也很大。本試驗(yàn)選用4個(gè)玉米自交系和7個(gè)玉米雜交種為材料，進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)。在試驗(yàn)中認(rèn)真觀察不同基因型的誘導(dǎo)過(guò)程中的不同狀態(tài)，并對(duì)出愈率和胚性愈傷率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)齊319×87-1、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA這3個(gè)基因型進(jìn)行了繼代繁殖的試驗(yàn)，以期選出愈傷誘導(dǎo)率、胚性愈傷率、繁殖能力都比較高的基因型，為下一步遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用4個(gè)玉米自交系87-1、鄭22、齊319、昌7-2和4個(gè)雜交種鄭22×87-1、齊319×87-1、昌7-2×HiⅡA、齊319×HiⅡA的幼胚為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6+2.0 mg/L 2，4-D+500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖;繼代培養(yǎng)基：N6+2.0 mg/L 2，4-D+700 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖;再生培養(yǎng)基：N6+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA+700 mg/L 脯氨酸+700 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖;分化預(yù)處理培養(yǎng)基：N6+700 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖。

1.3 方法

1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

取人工套袋授粉10～14 d 的不同基因型玉米幼雌穗，將果穗剝?nèi)グ~，用70%乙醇溶液浸泡1～2 min，在無(wú)菌條件下取出，并用無(wú)菌水沖洗3遍，用解剖刀切除籽粒頂部。取長(zhǎng)度1～2 mm的幼胚，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每個(gè)基因型根據(jù)材料的多少重復(fù)20～30皿。在無(wú)光照、26 ℃條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。根據(jù)幼胚的生長(zhǎng)狀況，4～7 d進(jìn)行切芽處理。切芽后全部轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中，15 d后調(diào)查，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率即出愈率。之后，將膨大后的愈傷夾碎成2塊轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中。2周后調(diào)查胚性愈傷塊數(shù)除以2，記為產(chǎn)生胚性愈傷的胚數(shù)，并計(jì)算胚性愈傷率。誘導(dǎo)過(guò)程如圖1所示。

愈傷組織按Armstrong（1994）描述的玉米愈傷組織分類標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查愈傷類型。本研究愈傷組織誘導(dǎo)率（出愈率）和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率（胚性愈傷率）計(jì)算公式為：

1.3.2 愈傷組織的繼代

不同基因型的愈傷組織繼代能力不同，繁殖力也有很大的區(qū)別。根據(jù)誘導(dǎo)的結(jié)果，進(jìn)一步的繼代試驗(yàn)選取了齊319×87-1、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA這3個(gè)基因型作為試驗(yàn)材料，各挑選生長(zhǎng)較一致的愈傷組織5皿，將其分成綠豆大小的小塊，每皿放入20塊愈傷，盡量保持大小均勻一致，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中繼代2周。連續(xù)3次繼代觀察愈傷的形態(tài)變化并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)繁的皿數(shù)，每次繼代都選取顆粒狀優(yōu)良胚性愈傷。第3次繼代時(shí)，選出5皿稱其初始愈傷質(zhì)量G1，繼代2周后再稱愈傷質(zhì)量G2，計(jì)算愈傷的生長(zhǎng)量。

[JZ]愈傷組織生長(zhǎng)量=（G2-G1）/G1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

影響玉米愈傷組織誘導(dǎo)的內(nèi)在因素是基因型。為了獲得產(chǎn)生胚性愈傷組織的優(yōu)良基因型，為進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，在同一培養(yǎng)基上對(duì)4個(gè)自交系和組配的4個(gè)雜交種的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)效果進(jìn)行了篩選試驗(yàn)，并對(duì)篩選過(guò)程中不同基因型的愈傷狀態(tài)做了詳細(xì)觀察。試驗(yàn)中不同的基因型材料胚性愈傷誘導(dǎo)率及愈傷的狀態(tài)差別很大（表1）。這些基因型幼胚接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2 d左右出現(xiàn)白色、淺黃色或無(wú)色愈傷組織。不同基因型的出愈率不同，愈傷組織的質(zhì)量和狀態(tài)不同。雜交種出愈率明顯高于自交系。就單個(gè)自交系而言，愈傷組織出愈率均低于由其作母本配制的雜交種的出愈率。母本出愈率高的雜交種出愈率也高，母本出愈率較低的雜交種的出愈率也低，而且雜交種胚性愈傷的形態(tài)與母本有很大的相似之處。

從表2可以看出，雜交種齊319×87-1、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA都有較高的出愈率和胚性愈傷率。自交系87-1、鄭22也能誘導(dǎo)出胚性愈傷，但鄭22誘導(dǎo)出的愈傷大都是較硬的塊狀，屬于Ⅰ型愈傷的范疇，不耐繼代，再生率低。自交系中只有87-1誘導(dǎo)出較好的Ⅱ型愈傷組織，但胚性愈傷率較低。

2.2 不同基因型的繼代能力

從表3可以看出，昌7-2×HiⅡA的繼代繁殖能力強(qiáng)，明顯高于另外2個(gè)基因型，這與昌7-2×HiⅡA的愈傷組織的狀態(tài)有關(guān)。昌7-2×HiⅡA愈傷十分松散，呈明顯的顆粒狀。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)出的愈傷，進(jìn)行3次繼代，愈傷的繁殖能力逐漸增強(qiáng)，經(jīng)過(guò)幾次繼代后愈傷的色澤也更鮮亮，狀態(tài)更好。

從表4、表5可知，齊319×87-1、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA這3個(gè)基因型之間愈傷組織的生長(zhǎng)量存在極顯著差異，不同基因型由于其愈傷狀態(tài)及內(nèi)在因素的影響，其繼代生長(zhǎng)能力存在很大的不同。

3 討論與結(jié)論

基因型是玉米組織培養(yǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要因素。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)不同基因型的自交系及雜交種誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，不同基因型的胚性愈傷誘導(dǎo)率、繼代能力有著顯著差異，且具一定的母本效應(yīng)。胚性愈傷誘導(dǎo)率高的自交系，由其組配的雜交種的誘導(dǎo)率也高，愈傷狀態(tài)也十分相似。本試驗(yàn)中鄭22×87-1胚性愈傷誘導(dǎo)率為83.86%，而昌7-2×HiⅡA胚性愈傷誘導(dǎo)率為41.15%，相差很多。但在繼代能力上由于昌7-2×HiⅡA高度松散，具有明顯的顆粒狀，其繼代擴(kuò)繁能力明顯高于鄭22×87-1，這說(shuō)明胚性愈傷誘導(dǎo)率和繼代繁殖能力之間沒(méi)有必然的聯(lián)系，這與曹墨菊等研究提出的愈傷組織的誘導(dǎo)率和繼代力之間相關(guān)不顯著，二者可能受不同的遺傳因子所控制的結(jié)果[10]一致。愈傷的質(zhì)量狀態(tài)是影響愈傷繼代的關(guān)鍵因素。有些材料雖然誘導(dǎo)出了愈傷，但繼代過(guò)程中逐漸褐化死亡，無(wú)法繼代下去。昌7-2×HiⅡA繁殖能力強(qiáng)，是最好的組培材料。鄭22×87-1、齊319×87-1誘導(dǎo)率和胚性愈傷率都較高，愈傷狀態(tài)良好，Ⅱ型愈傷居多，擴(kuò)繁能力也較好，也可以作為組培材料。自交系中只有87-1、鄭22誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織，但鄭22的愈傷組織屬于Ⅰ型愈傷的范疇，不耐繼代，再生率低，自交系中只有87-1誘導(dǎo)出較好的Ⅱ型愈傷組織。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，足夠黑暗的條件下有利于愈傷的生長(zhǎng)，愈傷組織表現(xiàn)為健壯、色澤鮮黃。暗度不夠時(shí)，愈傷容易轉(zhuǎn)成硬塊狀，失去顆粒結(jié)構(gòu)，向Ⅰ型愈傷轉(zhuǎn)變。剛誘導(dǎo)出的愈傷組織比較堅(jiān)硬，經(jīng)過(guò)3～4次繼代后，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、色澤鮮亮、增殖快，是進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的最好時(shí)期。

基因轉(zhuǎn)化最終要落實(shí)到轉(zhuǎn)入后的再生，怎樣讓帶有目的基因的愈傷組織成苗，以及壯苗生根，到最后移栽到大田都是很關(guān)鍵的因素。特別移栽是最后也是最重要的一步，對(duì)于組培苗來(lái)說(shuō)，特別幼嫩，生理機(jī)能弱，溫度、濕度、水分、透氣性等方面的因素都會(huì)影響移栽的成活率，水分和透氣不易控制，稍微操作不當(dāng)，就易死苗。如何提高玉米再生率[11]以及再生后組培苗的移栽成活率都值得進(jìn)一步研究，健全一套完備的誘導(dǎo)、繼代、再生以及移栽程序是非常必要的。

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