產(chǎn)油微藻的選育及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

張紅兵, 劉薈, 史秀英, 李會(huì)宣, 范道春

河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050061

21世紀(jì)，隨著工業(yè)化生產(chǎn)迅猛發(fā)展，人類(lèi)對(duì)化石能源的消耗有增無(wú)減，據(jù)報(bào)道，全球約80% 能源消耗來(lái)自化石燃料[1]。然而化石能源的不可再生性導(dǎo)致其儲(chǔ)存量日趨下降，同時(shí)使用中產(chǎn)生的污染，嚴(yán)重威脅著環(huán)境和人類(lèi)健康。我國(guó)人口眾多，是世界第二大能源消費(fèi)國(guó)，研發(fā)可再生清潔能源取代化石燃料迫在眉睫[2,3]。

生物燃料的開(kāi)發(fā)近年來(lái)如火如荼，有望成為石油能源的替代品[4]，而微藻作為第三代、第四代生物能源有著巨大優(yōu)勢(shì)[5]，微藻分為原核藻類(lèi)和真核藻類(lèi)，多為單細(xì)胞生長(zhǎng)，易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速、環(huán)境友好，可進(jìn)行光合作用[6]，含油量高，部分微藻油脂可達(dá)到50%～90%，占地少，較農(nóng)作物類(lèi)油脂、動(dòng)物油脂培養(yǎng)周期短，部分微藻可在海水、鹽堿地、廢水等地大規(guī)模培養(yǎng)，減少耕地資源的浪費(fèi)[7]。微藻富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、防止心血管疾病等生理保健功能。利用污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻并耦合生物質(zhì)能源生產(chǎn)，既可治理水污染、又可緩解能源緊缺，有益于人類(lèi)擺脫對(duì)化石資源的過(guò)度依賴(lài)[8-9]，然而，如何提高微藻的產(chǎn)油效率、降低微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本等問(wèn)題亟待解決[10]，因此篩選生長(zhǎng)狀況良好且產(chǎn)油率高的微藻，是微藻產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的關(guān)鍵技術(shù)之一。

我國(guó)幅員遼闊，不同區(qū)域氣候條件差異較大，一方水土養(yǎng)一方“藻”，不同區(qū)域的藻類(lèi)表現(xiàn)出的差異較大。石家莊位于華北平原腹地，四季分明、晝夜溫差較大，但夏季日照充足、氣溫高，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的藻株并不能適應(yīng)石家莊室外的培養(yǎng)條件，本試驗(yàn)試圖從石家莊本地自然河流采集更加適應(yīng)本地環(huán)境條件的藻種，在室外培養(yǎng)用于廢水處理，試驗(yàn)采用富集培養(yǎng)并結(jié)合18S rDNA鑒定,篩選生長(zhǎng)狀況良好、產(chǎn)油率高的微藻，然后利用響應(yīng)曲面法(RSM)耦合Box-Behnken設(shè)計(jì)探索微藻最佳異養(yǎng)培養(yǎng)條件，為微藻的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

水樣分別取自于河北樂(lè)源牧業(yè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)廢水、河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)人工湖水、正定縣護(hù)城河水以及石家莊滹沱河水。

1.2 藻種篩選

采用富集培養(yǎng)法對(duì)微藻進(jìn)行篩選，用紗布(50目紗布，3次折疊)過(guò)濾水樣以去除大型固體雜質(zhì)，取10 mL水樣加入90 mL BG11[11]培養(yǎng)液，放置于光照培養(yǎng)箱(GZX-400BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)內(nèi)培養(yǎng)[溫度為(27±1)℃、光照強(qiáng)度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h]至15 d左右。待微藻生長(zhǎng)至淺綠色時(shí)用接種環(huán)劃線到BG11固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(培養(yǎng)條件不變)至單菌落，選擇肥沃的單菌落接種到BG11液體培養(yǎng)基中，對(duì)微藻進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。抽取適量混合藻液，在顯微鏡下觀察微藻細(xì)胞形態(tài)，選取形態(tài)不同的藻種繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)3次，供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3 分析方法

藻細(xì)胞密度生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：測(cè)定微藻培養(yǎng)時(shí)間與藻細(xì)胞密度生長(zhǎng)的關(guān)系，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)微藻[溫度為(27±1)℃、光照強(qiáng)度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h],每天定時(shí)取樣，采用紫外分光光度計(jì)(UV-2500型，上海元析儀器有限公司)測(cè)定微藻680 nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，記錄數(shù)據(jù)。

生物量的測(cè)定：在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)微藻[溫度為(27±1)℃、光照強(qiáng)度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h]，待微藻生長(zhǎng)至穩(wěn)定期，將離心管在90℃烘箱中烘干至恒重(M0)，取混合均勻的微藻液30 mL置于上述烘干的離心管內(nèi)，離心5 min(4 000 r·min-1，4 ℃)，倒掉上清液，保留離心管底部離心產(chǎn)物，并用蒸餾水3次洗滌離心產(chǎn)物，以上離心操作步驟重復(fù)3次，隨后將離心產(chǎn)物放入冰箱內(nèi)冷凍(-20℃，2 h)，最后將離心產(chǎn)物在干燥箱中烘干(50℃)至重量恒重M1。以上操作步驟實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按如下公式計(jì)算生物量。

用冷凍干燥法測(cè)量藻細(xì)胞的油脂含量[12-13]。油脂含量按照以下公式計(jì)算得出。

最后計(jì)算油脂的產(chǎn)油率，油脂產(chǎn)率的計(jì)算公式如下。

式中,m為培養(yǎng)末期藻體生物量，m0為初始藻體生物量，n為培養(yǎng)末期藻體的油脂含量，n0為初始藻體油脂含量，t為培養(yǎng)時(shí)間，x為油脂產(chǎn)率。

用Microsoft Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)分析，并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)一步分析10株微藻生物量之間的差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。

1.4 藻種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：篩選的10株藻種經(jīng)分離純化后，用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。

對(duì)微藻進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：采用試劑盒(OMEGA BIO-TEKDNA，安諾倫生物科技有限公司)提取微藻基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：18S rDNA-F：5′-CAAGTTTCTGCCCTATCGCT-3′；18S rDNA-R：5′-GCTTTCGCAGTAGTTCGTCTT-3′。PCR程序?yàn)椋?94℃, 5 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)； 72℃, 7 min。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，切下目的條帶，將其用OMEGA BIO-TEK回收試劑盒回收，進(jìn)行測(cè)序(賽默飛世爾科技公司)，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行Blast序列比對(duì)，采用MEGA 7.0.14軟件進(jìn)行多重序列分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

第六，加強(qiáng)腸道的調(diào)理。養(yǎng)雞就是養(yǎng)腸道，腸道的健康程度決定了雞群的營(yíng)養(yǎng)吸收能力和抗病水平的高低，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定關(guān)系重大，根據(jù)雞群的腸道狀況，適當(dāng)?shù)奶砑游⑸鷳B(tài)制劑，用以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高飼料的消化利用率，減少腸道有害菌的數(shù)量，進(jìn)而達(dá)到降低料肉比和料蛋比，減少腸道疾病，提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。

1.5 異養(yǎng)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素基礎(chǔ)試驗(yàn)，選擇調(diào)控微藻培養(yǎng)基中碳源、磷源和鎂源濃度成分，其中以葡萄糖作為碳源設(shè)置3個(gè)濃度梯度分別為15、20、25 g·L-1。以K2HPO4·3H2O作為磷源分別為60、90、120 mg·L-1。以MgSO4·7H2O為鎂源設(shè)置3個(gè)濃度梯度分別為160、200、240 mg·L-1。按照Design-Expert(V8.0.6.1)軟件耦合BBD設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)(表1)，按照BBD中成分組合將這3種成分添加到含225 mL培養(yǎng)基錐形瓶中培養(yǎng)(表2)，共計(jì)17組試驗(yàn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為不添加碳源、磷源和鎂源的BG11液體，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[溫度為(27±1)℃、光照強(qiáng)度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h],每天搖瓶培養(yǎng)3次，定時(shí)取樣測(cè)定生物量，采用RSM對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株微藻篩選結(jié)果

由表3所示，本次試驗(yàn)共從4個(gè)取樣點(diǎn)取樣，每處取樣點(diǎn)在不同區(qū)域取樣3次，每次取樣500 mL·瓶-1，每次取樣2瓶，共計(jì)24個(gè)樣品，對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)后共篩選出10株藻株，形態(tài)多為圓形藻。護(hù)城河篩選的藻株最多，護(hù)城河篩選出4株藻，養(yǎng)殖廢水中篩選出2株藻，滹沱河篩選出2株藻，河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)人工湖篩選出2株藻。

表1 響應(yīng)曲面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)表Table 2 Response surface test table

表3 10株微藻細(xì)胞形態(tài)Table 3 Morphology of 10 microalgae strains

圖1 部分微藻照片F(xiàn)ig.1 Pictures of part microalga

圖1為部分微藻的顯微鏡照片，藻體呈綠色，單個(gè)微藻細(xì)胞長(zhǎng)度均在50 μm以?xún)?nèi)，有單生、對(duì)生、叢生藻細(xì)胞，形狀有球狀、紡錘狀、針形，藻種DK-1、DK-9肉眼可見(jiàn)鞭毛，藻種的鞭毛可用來(lái)繁殖或運(yùn)動(dòng)，其中，除藻種DK-9、DK-10不易沉降，其他藻種均易沉降，易沉降的微藻可降低采收成本，同一采樣區(qū)域可篩選出不同藻種。

2.2 微藻生長(zhǎng)曲線(microalgae growth curve)

如圖2所示為10株藻的細(xì)胞生長(zhǎng)密度曲線圖，不同藻屬的藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不同，1～9 d時(shí)10株微藻進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度值呈指數(shù)快速增長(zhǎng)，9 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞密度增長(zhǎng)緩慢，故選擇在第10 d收獲微藻，其中DK-3、DK-7的差異優(yōu)勢(shì)較為明顯，細(xì)胞密度曲線一直處于其他藻株的上方。

2.3 微藻理化指標(biāo)的比較

如圖3所示，10株微藻的生物量、油脂含量、單位體積生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率均有差異，這是由于不同藻株的生理生化特性有差異。其中藻株DK-3是滹沱河中篩選出的藻，生物量(1.86 g·L-1)、總脂含量(14.27%)、單位體積生物量產(chǎn)率(14.27%)、油脂產(chǎn)率(10.23 mg·L-1·d-1)四項(xiàng)指標(biāo)均為10株微藻中最高，比最低微藻DK-10的生物量(0.67 g·L-1)高出177.6% ，比總脂含量最低DK-8的5.81%高出145.6%。因此藻株DK-3具有較高的研究潛能，而從滹沱河篩選的另一株藻DK-6生物量和總脂含量并未表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明從同一區(qū)域篩選出的藻的生理指標(biāo)有所差異。從護(hù)城河篩選出的藻DK-7四項(xiàng)指標(biāo)也表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，生物量為1.43 g·L-1，總脂含量為10.96%，僅次于藻株DK-3。從養(yǎng)殖廢水中篩選出的藻株DK-8，生物量為1.15 g·L-1,但其總脂含量為5.81%。研究?jī)r(jià)值較低，結(jié)合圖2中的細(xì)胞密度，生長(zhǎng)后期藻種細(xì)胞密度表現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)趨勢(shì)與生物量?jī)?yōu)勢(shì)趨勢(shì)并不相同，如藻株DK-3的細(xì)胞密度曲線在10株藻中并不占優(yōu)勢(shì)，但其生物量生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)趨勢(shì)明顯。分析原因是由于藻種不同所導(dǎo)致的，不同藻種生長(zhǎng)時(shí)結(jié)團(tuán)率不同，結(jié)團(tuán)率影響細(xì)胞密度的測(cè)量。如圖3所示，10株微藻的四項(xiàng)基本指標(biāo)，使用SPASS 19.0軟件對(duì)10株微藻的油脂產(chǎn)率進(jìn)行方差分析，并通過(guò)LSD多重比較得出，微藻DK-3的油脂產(chǎn)率較高(P<0.05)。因此，微藻DK-3具有較好的產(chǎn)油脂能力，故選微藻DK-3作為后續(xù)研究對(duì)象。

圖2 10株微藻的生長(zhǎng)曲線 (n=3)Fig.2 Growth curves of 10 microalgae strains (n=3)

圖3 10株微藻的生物量、總脂含量、單位體積生物量產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率的比較Fig.3 Comparison of biomass, total lipid content, biomass yield per unit volume, and oil yield rate of >10 microalgae strains

2.4 藻種鑒定結(jié)果

提取藻種DK-3總基因組DNA，用特異性引物PCR擴(kuò)增出目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果如圖4，圖中左側(cè)條帶為Maker，右側(cè)為目標(biāo)產(chǎn)物條帶，將切下的目的條帶用OMEGA BIO-TEK回收試劑盒回收后測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果為707 bp。

如圖5所示，將所得序列，提交GenBank中進(jìn)行Blast序列比對(duì)分析，然后利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，藻種DK-3與柵藻(ScenedesmusmeyenJQ315792.1)的18S rDNA具有較高的相似性，兩者同源性高達(dá)99.37%，結(jié)合藻種DK-3的形態(tài)學(xué)分析，藻種DK-3隸屬于柵藻屬，初步鑒定為柵藻(Scenedesmusmeyen)。

2.5 藻種DK-3異養(yǎng)培養(yǎng)優(yōu)化結(jié)果

采用BBD設(shè)計(jì)3種培養(yǎng)基不同成分組合，共計(jì)17組試驗(yàn)組合，通過(guò)RSM對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立模型，進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)(表4)。結(jié)果表明，回歸模型極顯著(P<0.00 1)，失擬不顯著，該模型的擬合系數(shù)(R2)為0.987 1，說(shuō)明測(cè)量值與預(yù)測(cè)值具有較高的擬合度；校正決定系數(shù)(AdjR2)為0.970 4，表明有97.04%的響應(yīng)值變化可用該模型來(lái)解釋?zhuān)芏?Adeq Precisior)為24.619>4.0，進(jìn)一步說(shuō)明該模型具有良好的擬合度，能夠?qū)Y(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了綜合考察葡萄糖，K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O成分含量及其交互作用對(duì)微藻DK-3生長(zhǎng)的影響，采用 Design-Expert(V8.0.6.1)軟件輔助分析，3D 響應(yīng)曲面結(jié)果如圖6所示。

圖4 藻種DK-3的18S rDNA序列PCR電泳結(jié)果Fig.4 PCR electrophoresis results of 18S rDNA >sequences of algae DK-3

圖5 藻種DK-3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of algae species DK-3

表4 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

注：“**”表示差異在P<0.01水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“*”表示差異在P<0.05水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“ - ”表示差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖6展示了以葡萄糖、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O三者含量交互作用對(duì)微藻生物量的影響，其中圖6A顯示當(dāng)葡萄糖的濃度不變時(shí)，隨著MgSO4·7H2O含量的增加，微藻生物量值先升高后降低，當(dāng)葡萄糖濃度為20.33 g·L-1，MgSO4·7H2O濃度為203.90 mg·L-1時(shí)，兩者交互作用最明顯，生物量值達(dá)到最大5.49 g·L-1。由方差分析結(jié)果可知，單因素葡萄糖濃度、MgSO4·7H2O濃度及其兩者交互作用對(duì)微藻生長(zhǎng)量的影響均達(dá)到極顯著作用(P<0.01)。當(dāng)葡萄糖濃度在17～23 g·L-1，MgSO4·7H2O濃度在184～220 mg·L-1時(shí)對(duì)微藻生物量的提高最有效。

圖6B展示了葡萄糖濃度、K2HPO4·3H2O濃度對(duì)微藻生物量影響的交互作用，顯示當(dāng)葡萄糖濃度不變時(shí)，隨著K2HPO4·3H2O濃度的增加，微藻生物量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在葡萄糖濃度為20.33 g·L-1、K2HPO4·3H2O濃度為92.58 mg·L-1時(shí)微藻生物量達(dá)到峰值5.49 g·L-1，隨著K2HPO4·3H2O含量繼續(xù)增加，微藻生物量逐漸減少，有方差分析結(jié)果可知，單因素K2HPO4·3H2O濃度(P<0.05)，顯著水平為0.003 7，但兩者的交互作用并未達(dá)到顯著水平。

圖6C展示了K2HPO4·3H2O的濃度水平和MgSO4·7H2O濃度水平對(duì)微藻生物量影響的交互作用，顯示K2HPO4·3H2O濃度與MgSO4·7H2O濃度交互作用并不明顯，同方差分析結(jié)果一致。

利用該軟件分析得到微藻優(yōu)化培養(yǎng)條件為：葡萄糖為20.33 g·L-1、K2HPO4·3H2O為92.58 mg·L-1、MgSO4·7H2O為203.90 mg·L-1。為了方便實(shí)際操作，將DK-3的異養(yǎng)培養(yǎng)最終條件確定為：葡萄糖為20 g·L-1、K2HPO4·3H2O為90 mg·L-1、MgSO4·7H2O為200 mg·L-1，經(jīng)驗(yàn)證在此培養(yǎng)條件下，微藻DK-3經(jīng)240 h培養(yǎng)后，3組平行試驗(yàn)平均生物量為5.47 g·L-1，與模型預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明模型可行，油脂產(chǎn)量為1.28 g·L-1，比空白對(duì)照組藻種生物量3.37 g·L-1提高了62.31%。

A：葡萄糖與MgSO4·7H2O的交互作用；B：葡萄糖與K2HPO4·3H2O的交互作用；C：MgSO4·7H2O與K2HPO4·3H2O的交互作用。圖6 響應(yīng)面法三維圖Fig.6 Three-dimensional diagram of response surface

3 討論

近幾年微藻在廢水處理方面的作用逐步引起注意，微藻可利用廢水中的化合物生長(zhǎng)，如殘氮、殘磷，同時(shí)還可凈化水質(zhì)，減少水體富營(yíng)養(yǎng)化，微藻可處理的廢水種類(lèi)很多，可處理奶牛場(chǎng)廢水、味精廠廢水、市政污水等，甚至有使用尿液培養(yǎng)微藻研究[15-17]。本研究從石家莊本地自然水體中采集并篩選微藻藻種，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，并用SPASS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析，初步確定了一株產(chǎn)率油脂較高的微藻，并通過(guò)響應(yīng)面分析確定了微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基成分，為后續(xù)的微藻應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

將微藻作為制備生物能源的新原料，無(wú)疑是克服化石能源短缺及環(huán)境污染、實(shí)現(xiàn)能源循環(huán)利用的新曙光[18-19]，由于微藻的種類(lèi)和培養(yǎng)條件是微藻產(chǎn)油的重要影響因素[20]，試驗(yàn)中篩選出的藻種DK-3具有較高的生物量及油脂產(chǎn)率，在自養(yǎng)條件下，其油脂產(chǎn)率(10.23±2.63)mg·L-1和油脂產(chǎn)量240.0～290.9 mg·L-1，是黃秋婷等[21]自養(yǎng)培養(yǎng)收獲四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)油脂產(chǎn)率為(187.6 mg·L-1)的1.28～1.53倍，是涂澤敏等[22]自養(yǎng)培養(yǎng)柵藻油脂產(chǎn)量(131.69 mg·L-1)的1.82～2.21倍。

微藻異養(yǎng)培養(yǎng)可以加快其生長(zhǎng)速度，短期內(nèi)獲得大量目標(biāo)產(chǎn)物，但培養(yǎng)基組分對(duì)培養(yǎng)特性和油脂產(chǎn)率十分重要。葡萄糖是最常見(jiàn)的有機(jī)碳源，需求量高；磷元素是構(gòu)成微藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要元素，參與微藻蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)的合成[23-24]；鎂元素是光合作用和呼吸作用過(guò)程中的重要酶，如各種磷酸激酶和磷酸變位酶的激活劑，同時(shí)也是葉綠素合成的重要成分，還可作為DNA和RNA合成過(guò)程的催化劑，對(duì)微藻的生長(zhǎng)有舉足輕重的影響[25]。

MgSO4·7H2O含量對(duì)微藻生物量影響最為顯著，微藻生物量隨著MgSO4·7H2O含量的逐漸增高，呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，原因可能為MgSO4·7H2O濃度較低時(shí)，Mg2+供應(yīng)不足，抑制了其增殖，而MgSO4·7H2O濃度較高時(shí)，Mg2+供應(yīng)過(guò)量，可與培養(yǎng)基中的K+、Al3+等離子產(chǎn)生拮抗作用，同時(shí)溶液滲透壓也隨之升高，反而抑制微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。葡萄糖含量對(duì)微藻細(xì)胞生物量的影響僅次于MgSO4·7H2O，微藻生物量隨著葡萄糖含量的逐漸增高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖濃度過(guò)低時(shí)無(wú)法為微藻細(xì)胞提供足夠的有機(jī)碳源，抑制微藻細(xì)胞生長(zhǎng)；當(dāng)葡萄糖濃度過(guò)高時(shí)，微藻初始生長(zhǎng)過(guò)于迅速，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值，除葡萄糖以外的營(yíng)養(yǎng)元素消耗過(guò)快，同時(shí)導(dǎo)致代謝產(chǎn)物濃度較高，使得微藻細(xì)胞數(shù)量迅速降低。微藻生物量隨著K2HPO4·3H2O含量的逐漸增高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，主要原因可能是K2HPO4·3H2O濃度過(guò)低時(shí)無(wú)法滿(mǎn)足微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，K2HPO4·3H2O濃度過(guò)高時(shí)，高濃度的K+可與培養(yǎng)基中的多種離子產(chǎn)生拮抗作用，同時(shí)磷元素的含量過(guò)高，導(dǎo)致氮磷失衡，抑制微藻細(xì)胞分裂繁殖，生物量降低。因此，選擇適宜的葡萄糖、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O濃度能夠有效提高微藻的生物量。

雖然，微藻異養(yǎng)培養(yǎng)能提高微藻的生物量和生長(zhǎng)速率，但以葡萄糖作為碳源培養(yǎng)微藻價(jià)格昂貴，尋找價(jià)格低廉的碳源十分重要。空氣中的CO2可作為備選碳源[26]，已有研究將煙囪中的廢氣作為碳源[15]，可大大降低培養(yǎng)成本。同時(shí)選擇合適的光生物反應(yīng)器也可進(jìn)一步提高微藻的生物量及油脂含量[27]，本團(tuán)隊(duì)后續(xù)將進(jìn)一步展開(kāi)深入研究。