一種模塊化三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)的研制

劉 鵬，向俊西，楊麗斐，史愛(ài)華，劉 爽，呂 毅*

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安710061；2.精準(zhǔn)外科與再生醫(yī)學(xué)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西安710061）

0 引言

目前的生物基礎(chǔ)理論大多通過(guò)基于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的二維靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞試驗(yàn)得到。典型的二維靜態(tài)培養(yǎng)將來(lái)源人體或動(dòng)物組織的單一或混合細(xì)胞種在塑料或者玻璃平板上，浸泡在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，通過(guò)定期更換培養(yǎng)基移除細(xì)胞代謝產(chǎn)物、提供新的營(yíng)養(yǎng)成分。二維靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展已經(jīng)十分成熟，是生物學(xué)最重要的實(shí)驗(yàn)方法之一。但是組織器官中的細(xì)胞是三維結(jié)構(gòu)的，而且由血液循環(huán)系統(tǒng)不斷灌注。而在平板培養(yǎng)中，組織的立體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接徹底失去[1]，許多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難在動(dòng)物體內(nèi)重現(xiàn)，而即使費(fèi)時(shí)費(fèi)力在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)，由于種屬差異，相關(guān)結(jié)果在人體內(nèi)也時(shí)常出現(xiàn)偏差[2-3]。

三維灌注培養(yǎng)在三維靜態(tài)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上引入灌注攜氧培養(yǎng)基的方法模擬血液循環(huán)系統(tǒng)，能夠及時(shí)移除代謝產(chǎn)物、提供新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持培養(yǎng)體系（例如pH、氧氣、葡萄糖以及生長(zhǎng)因子）的穩(wěn)態(tài)[4-5]。三維灌注培養(yǎng)保留了與體內(nèi)類似的細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互連接，更能反映體內(nèi)的生理狀態(tài)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，同時(shí)又能體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性。將傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖嘟Y(jié)合，為進(jìn)一步研究體內(nèi)細(xì)胞的正常特征提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，可以用于研究組織的病理和生理過(guò)程，測(cè)試藥物毒性和有效性、評(píng)估生物材料安全性等[6-7]。灌注培養(yǎng)還能夠提供可控的支架強(qiáng)度、機(jī)械性能、剪切力、模擬流體動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞功能，有效增加組織擴(kuò)散能力[5，8-10]。此外，攜氧培養(yǎng)基能夠消除培養(yǎng)組織的大小限制，擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模，不僅能夠?yàn)樵偕t(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用提供大量的種子細(xì)胞，還減少了人力、物力和試劑的消耗[2，11]。

目前，三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)成熟商品，多由實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，未進(jìn)行系統(tǒng)整合。大多將蠕動(dòng)泵、氧合器、培養(yǎng)瓶、輸送管道簡(jiǎn)單組裝而成[12-14]。許多研究則根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行了設(shè)計(jì)以適用于不同組織工程支架，如水凝膠[15]、微流體[16-17]、骨支架[18]、聚合物支架[19-21]的培養(yǎng)，或者設(shè)計(jì)一些可以提供生物力學(xué)信息的生物反應(yīng)器[22]，少部分研究對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)的氧合部分進(jìn)行了設(shè)計(jì)[23]。但這些三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、影響因素多、難消毒、易污染，且制作工藝煩瑣、難以推廣，大大地限制了三維灌注培養(yǎng)的應(yīng)用[24-25]。因此，本研究設(shè)計(jì)了一種基于3D 打印技術(shù)的模塊化三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)，具有結(jié)構(gòu)合理、易消毒、污染少、制作成本低、穩(wěn)定性高、易于擴(kuò)展且操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，可以很方便地進(jìn)行基于脫細(xì)胞支架的三維灌注培養(yǎng)。

1 設(shè)計(jì)

針對(duì)目前的三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，本系統(tǒng)采用集成化、模塊化設(shè)計(jì)，將系統(tǒng)分為生物反應(yīng)器模塊、氧合模塊、動(dòng)力模塊和換液模塊，如圖1、2 所示。各模塊可以獨(dú)立包裝，并使用環(huán)氧乙烷滅菌，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)將各模塊簡(jiǎn)單連接即可，減少了操作步驟及可能的污染環(huán)節(jié)。各模塊的殼體均通過(guò)3D 打印制作而成，易于制作，方便推廣。其中生物反應(yīng)器模塊作為細(xì)胞培養(yǎng)的容器，裝載培養(yǎng)基及細(xì)胞支架復(fù)合物。氧合模塊裝載膜肺、空氣過(guò)濾器、氣泡過(guò)濾器等，為該培養(yǎng)系統(tǒng)的核心組件。動(dòng)力模塊為整個(gè)系統(tǒng)的培養(yǎng)基及氣體提供動(dòng)力。換液模塊用來(lái)更換培養(yǎng)基，可以對(duì)換液接口進(jìn)行消毒，避免換液過(guò)程引起污染。

1.1 生物反應(yīng)器模塊設(shè)計(jì)

圖1 模塊化三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 模塊化三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)物圖

生物反應(yīng)器模塊主體為80 ml 藍(lán)口瓶，瓶體作為細(xì)胞培養(yǎng)容器，瓶蓋通過(guò)穿板魯爾接頭（桑連電子材料，SL5/32-4.0 mm）連接灌注管路，其中接口1 連接細(xì)胞支架復(fù)合物，接口2 連接換液模塊，且通過(guò)此口移除舊培養(yǎng)基及加入新培養(yǎng)基。

1.2 氧合模塊設(shè)計(jì)

氧合模塊殼體通過(guò)3D 打印制作而成，內(nèi)部安裝有小動(dòng)物膜肺（西安西京醫(yī)療用品有限公司，大鼠型膜肺）、空氣過(guò)濾器（廣州桑連電子材料有限公司，8 mm 過(guò)濾器）以及氣泡過(guò)濾器（湖南省綠洲惠康發(fā)展有限公司，IS-GA3），各組件之間通過(guò)硅膠軟管連接。氧合模塊留有空氣過(guò)濾器觀察窗，可監(jiān)測(cè)氧合模塊液位變化，預(yù)防氣泡進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.3 動(dòng)力模塊設(shè)計(jì)

動(dòng)力模塊由蠕動(dòng)泵（蘭格恒流泵有限公司，BQ50-1J-A）和空氣泵（桑連電子材料，SL-300）組成，放置在培養(yǎng)箱旁，安裝在30 cm 高鐵架臺(tái)上，通過(guò)12 V直流電源供電。蠕動(dòng)泵灌注速度調(diào)節(jié)范圍為0～20 ml/min，空氣泵流量調(diào)節(jié)范圍為0～300 ml/min。該模塊為培養(yǎng)基及氧氣提供循環(huán)動(dòng)力。

1.4 換液模塊設(shè)計(jì)

換液模塊由10 cm 長(zhǎng)硅膠管及3D 打印長(zhǎng)方體構(gòu)成，長(zhǎng)方體內(nèi)部呈倒錐形，底部正中裝有深紫外LED 燈[深圳市永霖科技有限公司，TO39，波長(zhǎng)（260±5）nm]，可將硅膠軟管接頭插入換液模塊中進(jìn)行紫外線照射滅菌。

2 使用方法

使用之前對(duì)生物反應(yīng)器模塊、氧合模塊及換液模塊使用環(huán)氧乙烷滅菌。在生物反應(yīng)器中加入50～60 ml 普通或含有攜氧成分（如氟碳化合物）的培養(yǎng)基，將該系統(tǒng)按照?qǐng)D1 所示連接。打開(kāi)蠕動(dòng)泵及空氣泵電源，通過(guò)調(diào)整氧合模塊的傾斜角度來(lái)調(diào)整氣泡過(guò)濾器液平高度，將液平高度控制在液壺的2/3 位置。在接口1 處連接待培養(yǎng)的細(xì)胞支架復(fù)合物。將生物反應(yīng)器及氧合模塊放入培養(yǎng)箱中，將動(dòng)力模塊置于培養(yǎng)箱旁，調(diào)整蠕動(dòng)泵及空氣泵至適合速度，對(duì)細(xì)胞支架復(fù)合物進(jìn)行灌注培養(yǎng)。每日觀察培養(yǎng)系統(tǒng)運(yùn)行狀況，并定期更換培養(yǎng)基。更換培養(yǎng)基前打開(kāi)換液模塊的深紫外LED 燈開(kāi)關(guān)，對(duì)換液接頭照射消毒2 h，關(guān)閉動(dòng)力模塊電源，隨后連接一次性50 ml 無(wú)菌注射器，移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。使用另一只注射器吸取50 ml 新鮮培養(yǎng)基，連接換液接口注入新培養(yǎng)基，完成對(duì)該培養(yǎng)系統(tǒng)的換液。之后再次打開(kāi)動(dòng)力模塊開(kāi)關(guān)繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

3 創(chuàng)新點(diǎn)

本文研制的三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)具有以下創(chuàng)新點(diǎn)：（1）采用模塊化設(shè)計(jì)，安裝方便快捷，且各模塊可進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，解決了既往三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難消毒、易污染的難題。（2）通過(guò)動(dòng)力模塊外置解決了動(dòng)力部分產(chǎn)熱過(guò)多的難題，降低了對(duì)培養(yǎng)箱溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)的要求。（3）采用標(biāo)準(zhǔn)化組件制作而成，制作成本低，方便推廣。（4）可通過(guò)局部紫外線照射滅菌，減少了更換培養(yǎng)基過(guò)程中污染的可能，提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

4 實(shí)驗(yàn)

4.1 材料

4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康3 月齡SD 大鼠，質(zhì)量250～300 g，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)溫度保持在18～25 ℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵照國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006 年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

4.1.2 試劑及儀器

試劑為DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素（Hyclone）、小牛血清（Gibco）和胰蛋白酶（碧云天）。儀器為本文研制的三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)和CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 3110）。

4.2 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠脾臟脫細(xì)胞支架制備方法參照本課題組前期研究[26-28]：經(jīng)脾動(dòng)脈插管獲取大鼠脾臟，脾臟離體后繼續(xù)去離子水灌注30 min，隨后浸入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中凍存于-80 ℃冰箱備用。反復(fù)凍融脾臟2 次后置入燒杯中，連接蠕動(dòng)泵，設(shè)置灌注速度為4 ml/min，先后應(yīng)用0.2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、PBS 經(jīng)由脾動(dòng)脈持續(xù)灌注，直至脫去脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用PBS 沖洗后使用0.1%過(guò)氧乙酸進(jìn)行支架消毒，保存在含3%青鏈霉素的PBS 中。

L02 細(xì)胞培養(yǎng)：采用10%小牛血清及1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基擴(kuò)增L02 細(xì)胞至4×107個(gè)，消化離心后使用4 ml 培養(yǎng)基重懸。

采用脾動(dòng)脈間斷注射的方法進(jìn)行再細(xì)胞化脾臟脫細(xì)胞支架。將再細(xì)胞化脾臟脫細(xì)胞支架連接于三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)，整體置于37 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中。使用10%小牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基循環(huán)灌注，培養(yǎng)基灌注速度設(shè)置為1 ml/min，空氣泵速度設(shè)置為10 ml/min，間隔3 d 更換培養(yǎng)基。對(duì)培養(yǎng)的再細(xì)胞化支架進(jìn)行掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、HE 染色以及Ki67免疫熒光染色觀察。

4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。大體觀可見(jiàn)L02 細(xì)胞在脾臟脫細(xì)胞支架內(nèi)呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)塊體積逐漸增大。培養(yǎng)1 周后的再細(xì)胞化脾臟支架SEM 結(jié)果顯示細(xì)胞與支架黏附緊密，細(xì)胞在支架內(nèi)按照脾臟支架內(nèi)部管腔及血竇結(jié)構(gòu)分布。HE染色結(jié)果可見(jiàn)L02 細(xì)胞呈現(xiàn)典型的肝細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞核藍(lán)紫色、圓形或橢圓形、大而明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富，提示細(xì)胞活性良好。免疫熒光染色可見(jiàn)Ki67 陽(yáng)性率為（38±7）%，提示支架中細(xì)胞增殖活躍。且利用本系統(tǒng)進(jìn)行的三維灌注培養(yǎng)均未發(fā)生污染。

5 結(jié)語(yǔ)

三維灌注培養(yǎng)作為一種能夠直接模擬體內(nèi)真實(shí)環(huán)境的新技術(shù)，是一種理想的細(xì)胞培養(yǎng)方式。但是三維灌注培養(yǎng)技術(shù)不成熟，既往培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易污染，限制了三維灌注培養(yǎng)的發(fā)展應(yīng)用。本研究設(shè)計(jì)的三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)合理、易消毒、污染少、制作成本低、穩(wěn)定性高、易于擴(kuò)展并且操作簡(jiǎn)單，值得推廣應(yīng)用。

圖3 模塊化三維灌注培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

但本設(shè)計(jì)也存在一些不足之處需進(jìn)行改進(jìn)：（1）控制及監(jiān)測(cè)模塊未集成?？蓪?duì)動(dòng)力模塊的控制系統(tǒng)進(jìn)行集成及智能化，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程控制氣體及培養(yǎng)基流量，并能遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)系統(tǒng)運(yùn)行狀況。（2）缺少儲(chǔ)液及廢液模塊?？稍黾觾?chǔ)液及廢液裝置，并實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程控制換液過(guò)程，盡可能減少換液環(huán)節(jié)引入污染的機(jī)會(huì)。（3）動(dòng)力模塊產(chǎn)熱過(guò)多?？赏ㄟ^(guò)蠕動(dòng)泵改裝水冷裝置，增加散熱效率，將動(dòng)力模塊置入培養(yǎng)箱中，進(jìn)一步減少污染的機(jī)會(huì)。（4）圓形生物反應(yīng)器模塊不利于觀察。下一步可改為定制的方形玻璃瓶，以利于觀察細(xì)胞支架復(fù)合物狀態(tài)。