干細(xì)胞技術(shù)在皮膚放射損傷中的應(yīng)用

電離輻射可致皮膚非典型角化引起的干燥脫皮、表皮脫落和血管生成抑制逐漸導(dǎo)致皮膚潰爛，誘導(dǎo)基底膜的急性退行性改變，增加血管的通透性，減少新生血管形成。最后，嚴(yán)重輻射灼傷的主要特征是發(fā)生不可預(yù)測的慢性炎癥，導(dǎo)致皮膚的表面壞死并向深度延伸。

傳統(tǒng)的治療方法主要是手術(shù)和常規(guī)完善治療，它結(jié)合了大的放射性損傷組織切除術(shù)與經(jīng)典的整形外科技術(shù)，經(jīng)典的治療方法源于熱或電燒傷的管理。手術(shù)是導(dǎo)致非常高的發(fā)病率和殘疾率的最終選擇，切除病灶很難保持穩(wěn)定，因為與熱燒傷相比，正常組織和放射性損傷組織之間很難界定。此外，每一個操作都會刺激炎癥發(fā)展，促進(jìn)缺血和纖維化過程。嚴(yán)重的照射(25 Gy的X射線)可導(dǎo)致皮膚廣泛的壞死，需要重復(fù)手術(shù)治療。

表皮干細(xì)胞在皮膚穩(wěn)態(tài)和傷口修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但是它們的再生能力較弱。因此，開發(fā)一種新的治療方法，使用成人干細(xì)胞來控制炎癥、加速表皮再植和血管生長，成為受照射后組織再生或修復(fù)的重大挑戰(zhàn)。

此前，7名曾在法國(IRSN-Percy聯(lián)合醫(yī)院)治療的高度輻射受照者接受了局部注射自體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，手術(shù)切除和皮膚移植。MSC從自體骨髓(BM)抽吸物獲得，體外擴(kuò)增培養(yǎng)15～17天。 根據(jù)傷口動力學(xué)的嚴(yán)重程度和進(jìn)展，患者接受2～5次MSC的重復(fù)注射。治療過程中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞注射也與疼痛閾值的下調(diào)有關(guān)，表明MSC參與局部炎癥控制?？傊覀冃枰M(jìn)一步研究開發(fā)用于放射性皮膚損傷治療的標(biāo)準(zhǔn)干細(xì)胞療法。

1 干細(xì)胞

1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)

幾十年來，使用成體干細(xì)胞的細(xì)胞療法已經(jīng)挽救了數(shù)千名患者。

骨髓源性造血干細(xì)胞治療法首次應(yīng)用于1956年，用于白血病和淋巴瘤的治療。Friedenstein等人最先提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的說法，后來發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞有成體干細(xì)胞特性，因為它們可以分化為軟骨、骨、脂肪和肌腱。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接分化成這些軟骨、骨、脂肪和肌腱等組織或間接通過蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子的分泌和免疫抑制。

間充質(zhì)干細(xì)胞容易從各種組織來源例如骨髓、脂肪、臍帶和其他來源獲得，并且容易分離，可大規(guī)模體外擴(kuò)增，冷凍保存損失少。間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸入后可全身遷移，特別是在缺氧或組織損傷的區(qū)域。

即使全身應(yīng)用同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞也沒有任何副作用，因為它們有免疫調(diào)節(jié)作用。間充質(zhì)干細(xì)胞有可靠的安全性，移植后尚未顯示腫瘤形成，并且通過廣泛測試已被證明在心血管和神經(jīng)變性疾病、移植物抗宿主病(GvHD)和自身免疫疾病的臨床前和臨床研究中都是有效的。由于間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為成骨細(xì)胞，早期研究系統(tǒng)性地建立了間充質(zhì)干細(xì)胞移植安全性的良好臨床記錄。因此，高劑量輻射暴露后，注射間充質(zhì)干細(xì)胞可用于治療潰瘍性皮膚病，并可使肌肉恢復(fù)。

裸鼠肌肉輻射損傷模型：移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，大多數(shù)植入的人類細(xì)胞聚集在弱損傷區(qū)域。移植后3天，皮膚中可觀察到來自供體的骨髓細(xì)胞，接下來的21天中數(shù)量不斷增加。已被證實，在這3周期間，可以通過炎癥反應(yīng)非特異性地募集骨髓細(xì)胞。實驗觀察到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞到皮膚上皮細(xì)胞中的定位與先前報道的結(jié)果一致：在雄性至雌性小鼠移植模型中，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在皮膚上皮細(xì)胞中直接分化。

混合中子輻射非人靈長類動物模型：注入綠色熒光蛋白標(biāo)記的非人靈長類間充質(zhì)干細(xì)胞的不同組實驗，已經(jīng)顯示間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)先植入再生組織。可能有兩個主要機(jī)制：第一種機(jī)制是旁分泌效應(yīng)，通過移植細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和生長因子引發(fā)宿主相關(guān)的信號通路影響微環(huán)境，增加血管生成，減少細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞外基質(zhì)重塑(通過β轉(zhuǎn)化生長因子產(chǎn)生)；第二種機(jī)制，臨床證據(jù)表明，干擾素γ的T細(xì)胞增殖和分泌的抑制作用是由干細(xì)胞分泌的前列腺素E2介導(dǎo)的，CD14+單核細(xì)胞通過白介素-1β依賴性途徑促進(jìn)干細(xì)胞的免疫抑制作用。

除了間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)性旁分泌效應(yīng)，這些細(xì)胞支持角質(zhì)細(xì)胞的群體生長和分化。臨床使用人體間充質(zhì)干細(xì)胞可修復(fù)意外照射后患者的皮膚損傷。

1.2 脂肪來源基質(zhì)細(xì)胞

骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞成功移植后輻射誘發(fā)并發(fā)癥的減少，開啟了皮膚放射綜合征治療的新策略。

眾所周知，脂肪干細(xì)胞在延遲愈合中的臨床應(yīng)用有待研究，有可能因此形成一種新的治療方法。脂肪干細(xì)胞是多能干細(xì)胞的來源，其參與傷口愈合的新血管形成和上皮再生。應(yīng)用脂肪干細(xì)胞促進(jìn)傷口在生理和病理情況下愈合是新的觀點。

脂肪組織參與廣泛的生理過程，包括凋亡、炎癥、血管生成、凝血、纖維蛋白溶解和血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)。研究表明，來源于脂肪組織的細(xì)胞可用于動物模型中的造血、血管形成或骨骼肌恢復(fù)。脂肪干細(xì)胞的可塑性為再生臨床醫(yī)學(xué)帶來了新的希望。

脂肪細(xì)胞的前體遍及成年生命的體內(nèi)，并且可以根據(jù)生理或病理生理狀況增殖和/或募集。這些細(xì)胞的分化導(dǎo)致形態(tài)和生物化學(xué)變化，細(xì)胞變成圓形開始積累甘油和脂質(zhì)空泡。通常認(rèn)為前脂肪細(xì)胞比成熟脂肪細(xì)胞更有利于作為干細(xì)胞，因為它們能夠增殖獲得更大的細(xì)胞數(shù)量，以及分化獲得特異性細(xì)胞。

脂肪組織是多能細(xì)胞的來源，具有分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、生肌細(xì)胞和雌激素細(xì)胞的能力。自體脂肪來源的干細(xì)胞(ADSC)可以通過脂肪抽吸或腹部手術(shù)獲得。這些細(xì)胞也被認(rèn)為是間充質(zhì)細(xì)胞，因為它們衍生自脂肪組織，脂肪組織又衍生自間充質(zhì)，類似于骨髓。研究表明，脂肪組織的基質(zhì)血管細(xì)胞有促血管生成前體細(xì)胞的能力，與骨髓單核細(xì)胞相當(dāng)。它們能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞并摻入血管中，從而促進(jìn)新血管形成。

小鼠ADSC脂肪組織還可以在體外自發(fā)產(chǎn)生功能性的心肌細(xì)胞樣細(xì)胞，在急性心肌梗塞模型中存活并分化為造血組織。研究報道，移植的ADSC可以產(chǎn)生和/或支持主要的造血譜系，從而挽救受到致死劑量照射的小鼠。ADSC參與傷口愈合過程的第一部分，因為細(xì)胞刺激新血管形成并且促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子分泌。ADSC通過膠原分泌改善皮膚質(zhì)量，分化成角質(zhì)形成細(xì)胞和產(chǎn)生旁分泌因子(KGF)以調(diào)節(jié)修復(fù)皮膚傷口的能力，在輻射條件下加速再生上皮化。

ADSC細(xì)胞可以以最小損傷大量獲得，使用微創(chuàng)的脂肪抽吸也容易收獲脂肪組織，這些細(xì)胞可以冷凍保存至少6個月，確保以后的臨床應(yīng)用。這些都使得ADSC更加適合用于皮膚傷口患者的自體細(xì)胞治療。

1.3 多能干細(xì)胞

研究多能干細(xì)胞需要鑒定分化的最佳階段，并證明這些細(xì)胞可以在沒有癌癥發(fā)生的情況下使用。

同種異體細(xì)胞與自體細(xì)胞的問題仍然存在。自體細(xì)胞更昂貴和更可變，提取和培養(yǎng)時間長限定了不能用于急用。同種異體細(xì)胞可提供現(xiàn)成產(chǎn)品，但需要避免排斥反應(yīng)。

所有這些需通過改進(jìn)移植物的整合來實現(xiàn)，包括血管形成(動脈管道和微血管系統(tǒng)的生長)的控制，炎癥和瘢痕的形成。

1.4 組織工程

與其他研究領(lǐng)域一樣，有些具體的科學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注于治理方法。將干細(xì)胞用于組織工程應(yīng)用需要解決許多問題，包括組織采集、細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化。收獲組織的方法可以對細(xì)胞增殖和分化的能力產(chǎn)生不同影響，從而將可變性引入每個樣品的細(xì)胞回收和培養(yǎng)過程中。此外，因為組織工程中干細(xì)胞的使用是初期的研究領(lǐng)域，尚未明確細(xì)胞一旦在生物材料上培養(yǎng)將如何表現(xiàn)。

組織工程是指體外三維組織的生長，目的是建立更多的生物相關(guān)模型用于體外研究或組織的體內(nèi)再生治療。最常見的涉及使用多孔及可降解生物的支架的細(xì)胞接種，其他方法包括將細(xì)胞澆鑄成水凝膠或產(chǎn)生僅由細(xì)胞和它們分泌的基質(zhì)組成的不含支架的組織。合成材料在可制造性方面的優(yōu)點——易于制造，廉價及可重復(fù)使用。然而，合成物通常有較差的生物相容性，容易引起異體炎癥反應(yīng)，有時局部會釋放有毒的降解產(chǎn)物。生物反應(yīng)器通常用于組織工程中，提供電和機(jī)械調(diào)節(jié)或通過灌注系統(tǒng)將營養(yǎng)物遞送至組織。

經(jīng)過十多年的研究活動，干細(xì)胞科學(xué)似乎越來越朝向之前預(yù)期的方向發(fā)展。臨床試驗已經(jīng)建立了細(xì)胞遞送技術(shù)，并且實現(xiàn)了在人體實驗中建立可行性、安全性和早期功效的方案。

2 7例采用手術(shù)聯(lián)合自體MSC治療成功患者

法國臨床實踐支持使用自體MSC輸注修復(fù)受害者在意外照射后的皮膚和潛在的肌肉損傷(IRSN專家共識和法國佩爾西醫(yī)院醫(yī)療管理共識)。以下是MSC與皮膚移植或手術(shù)組合治療應(yīng)用的7個病例。

患者1于智利(2005年)意外受照射，治療了兩個不同的病變(手和臀部)。患者2在塞內(nèi)加爾(2006年)意外受照射，患者3在突尼斯意外受照射(2008年)，患者4在厄瓜多爾(2009年)意外受照射，患者5在委內(nèi)瑞拉(2010年)意外受照射，患者6在加蓬(2010年)意外受照射，患者7是智利(2005年)意外受照射。根據(jù)開發(fā)的METREPOL分級系統(tǒng)對放射性燒傷的嚴(yán)重性進(jìn)行分級。

根據(jù)隨訪結(jié)果，其中對于第一個患者隨訪達(dá)到7年之久，獲得的臨床結(jié)果成功證明干細(xì)胞治療具有高度的臨床意義。干細(xì)胞注射治療的成功和隨后減少輻射誘發(fā)的并發(fā)癥，可能在皮膚放射綜合征治療策略方面打開全新的道路。智利病人(智利，2005年)的醫(yī)療管理被選為嚴(yán)重放射性燒傷醫(yī)療管理的臨床原則基礎(chǔ)。在此經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，對于其他6例過度暴露于γ放射源的患者，用的是同樣的創(chuàng)新治療策略——將早期劑量測定引導(dǎo)的病灶切除術(shù)和MSC細(xì)胞治療相結(jié)合。

3 結(jié)論和觀點

目前的數(shù)據(jù)表明，雖然MSC在再生醫(yī)學(xué)中首先基于其干細(xì)胞樣品質(zhì)和其它特征如其抗增殖和抗炎特性被提出用于治療目的，但近年來，臨床治療使用其他祖細(xì)胞的有益效果或不同類型的干細(xì)胞的共移植進(jìn)化，因為內(nèi)皮或上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞可以被作為皮膚重建的新治療策略。

自從發(fā)現(xiàn)各種干細(xì)胞群體和隨后的提取和培養(yǎng)用于治療用途的能力，已經(jīng)對再生損傷組織的潛力進(jìn)行了大量研究。然而，過去十年表明，將干細(xì)胞治療的潛力轉(zhuǎn)化為實踐并不容易，在這種治療達(dá)到其全部潛力之前，需要解決許多問題。

測試使用干細(xì)胞作為再生醫(yī)學(xué)的治療策略的其他研究應(yīng)該研究人類創(chuàng)傷和其他病理狀況。用于軟組織重建的干細(xì)胞組織工程可研究其它材料和策略，即支架/基質(zhì)、海綿的開發(fā)。目前正在研究以增強(qiáng)植入干細(xì)胞的募集、存活和長久。如果再生成功，大量的干細(xì)胞需要保持存活，分化成完全功能的細(xì)胞并駐留在組織中。干細(xì)胞通過旁分泌效應(yīng)發(fā)揮作用，通過對供體干細(xì)胞和宿主組織之間的分子相互作用可發(fā)現(xiàn)這種作用的機(jī)制。

本文內(nèi)容源于IAEA、WHO相關(guān)技術(shù)叢書。