經(jīng)頸動脈插管行Krebs-Henseleit液預(yù)交換的離體心臟灌注技術(shù)

郭書棟 李彤 米睿 鄭偉鋒 胡曉旻 齊振昌 宋元申 王成蕊

1天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院（天津300170）；2天津市第三中心醫(yī)院心外科（天津300170）；3天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心（天津300170）

離體心臟灌注技術(shù)是指將實(shí)驗(yàn)動物心臟離體后，連接到特定的體外灌流裝置，以血液或灌流液灌注心臟，進(jìn)行心臟體外研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)［1］。目前常用的離體心臟灌注模式有Langendorff 和Working heart 兩種［2-3］。因?yàn)榕懦松窠?jīng)體液干擾，具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，離體心臟灌注技術(shù)在心血管生理、生化及藥理等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［4-8］。然而，傳統(tǒng)的心臟離體手術(shù)中存在一些不可避免的局限性［9-11］：心臟離體過程中存在缺氧、停止灌注；修剪、排空心臟過程中的停跳和機(jī)械損傷；恢復(fù)灌注后缺血-再灌注損傷及心律失常等。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)心臟離體灌注技術(shù)的不足，本實(shí)驗(yàn)探索了一種新的心臟離體灌注技術(shù)，避免了大鼠心臟離體過程缺血、缺氧、停跳，缺血再灌注等損傷，克服了再灌注后心律失常等局限性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級SD 大鼠20 只，雄性，體質(zhì)量300～350 g，由中國食品藥品檢定研究院（大興）提供［SCXK（京）2017-0005］，本研究在實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中完全做到按實(shí)驗(yàn)動物使用“減少、替代和優(yōu)化”3R 原則給予人道的關(guān)懷，并經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 設(shè)備及試劑離體心臟灌流系統(tǒng)（中國普升科技有限公司，Radnoti）、PH 儀（中國上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，PHS-3C）、多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀（美國Biopac MP150）、小動物呼吸機(jī)（美國Kent Scientific 公司，TOPO）、小動物外科器械包、肝素鈉（森諾生物科技有限公司）、余分析純試劑均購于天津福成化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Krebs-Henseleit液（K-H液）配置配置K-H液，以1 L為例：氯化鈉6.924 g、碳酸氫鈉2.080 g、氯化鉀0.350 g、磷酸二氫鉀0.163 g、葡萄糖1.800 g、硫酸鎂0.144 g、二水氯化鈣0.265 g，將前6 種分析純試劑依次溶于常溫去離子水，二水氯化鈣單獨(dú)溶解后緩慢倒入，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，定容? L；K-H 液pH 7.3～7.4，所有K-H 液配置完成后均進(jìn)行過濾。

1.2.2 分組及離體心臟灌注模型制備應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將20 只SD 大鼠隨機(jī)分為兩組：傳統(tǒng)離體心臟灌注技術(shù)組（T 組，n= 10）和改進(jìn)離體心臟灌注技術(shù)組（M 組，n=10）。

1.2.2.1 傳統(tǒng)離體心臟灌注技術(shù)組（T 組）及操作步驟（1）禁食12 h；（2）稱重；（3）全身肝素化：以200 IU/100 g 劑量肝素于術(shù)前1 h 腹腔注射；（4）麻醉：以3%的戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射；（5）固定；（6）快速開胸，暴露心臟；（7）游離心臟：提起心臟根部，剪斷心臟遠(yuǎn)端血管，盡量保留較長的主動脈；（8）心臟排血與修剪，將心臟放到含有4 ℃的生理鹽水平皿中按壓心臟，擠出心腔中殘余血液，修剪主動脈，方便掛機(jī)灌注；（9）心臟掛機(jī)灌注，灌注針插入主動脈不宜過深，以免插入左室，影響心臟灌注；從開胸到心臟離體灌注保持在90 s 以內(nèi)完成。

1.2.2.2 改進(jìn)離體心臟灌注技術(shù)組（M 組）及操作步驟（1）禁食12 h；（2）稱重；（3）麻醉：以3%的戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射；（4）固定、脫毛、消毒。（5）頸部切開，氣管插管；（6）開胸和心臟暴露；（7）游離胸腺；（8）游離右側(cè)頸動脈；（9）游離主肺間隔；（10）頸動脈插管；（11）經(jīng)頸動脈K-H 液預(yù)交換：用醫(yī)用延長導(dǎo)管將頸動脈灌注針頭和Radnoti 灌注系統(tǒng)連接，連接前注意全程管路預(yù)充K-H 液排氣。剪破下腔靜脈與右側(cè)上腔靜脈，剪破左心耳，打開動脈夾，開始經(jīng)頸動脈灌注心臟，待心臟跳動5 s 后，夾閉主動脈，再持續(xù)灌注2 min，使心臟血液交換為K-H 液；（12）心臟游離；（13）頸動脈-主動脈交換灌注：關(guān)閉頸動脈灌注通道，交換至主動脈灌注（圖1）。

1.2.2.3 灌注策略兩組均采用Radnoti 離體心臟灌注系統(tǒng)灌注，維持以下恒定狀態(tài)：恒溫：（37 ±0.5）℃，恒壓：（65 ± 5）mmHg；以95%O2+5%CO2混合氣持續(xù)對K-H 液進(jìn)行鼓泡式氧合。

1.2.3 心臟復(fù)蘇及存活時(shí)間記錄以K-H 液灌注開始為時(shí)間零點(diǎn)，分別記錄兩組（1）離體心臟灌注-復(fù)跳時(shí)間：灌注開始到心臟第一次起跳的時(shí)間；（2）復(fù)跳-穩(wěn)定跳動時(shí)間：心臟復(fù)跳到第1 次1 min內(nèi)無心律失常的時(shí)間；（3）存活時(shí)間：心臟灌注復(fù)跳開始到心臟停跳時(shí)間。

1.2.4 冠脈流量測定兩組均在以下時(shí)點(diǎn)測量：開始灌注后1、5、10、15、30 min、1、2 h 時(shí)1 min 內(nèi)的冠脈流量。

圖1 改進(jìn)離體心臟灌注技術(shù)手術(shù)流程圖Fig.1 The modified surgical procedure diagram of isolated cardiac perfusion technique

1.2.5 心率與心律失常評分兩組開胸前均記錄基礎(chǔ)心率，改進(jìn)組在心臟未離體前以3 個(gè)電極分別接到大鼠的右上肢，左下肢，右下肢記錄心電，心臟離體后兩組均以接觸式電極貼于心尖部，以Biopac MP150 多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀持續(xù)記錄心電圖參數(shù)。心律失常評判參考Curis-Walker Score E 評分標(biāo)準(zhǔn)［12］：（1）0 分：＜20 次室性早搏（VPB）；（2）1分：21 ～100次VPB；（3）2分：＞100次VPB和/（或）1 ～3 次室性心動過速（VT）；（4）3 分：＞3 次VT；（5）4 分：可自發(fā)轉(zhuǎn)為竇律的室顫（SVF）；（6）5 分：1 ～2 次不可轉(zhuǎn)為竇律的室顫（NVF）；（7）6 分：3 ～5 次NVF；（8）7 分：＞5 次NVF，對兩組2 h 內(nèi)心律失常發(fā)生進(jìn)行評分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，生存及復(fù)跳時(shí)間以中位數(shù)表示，組間比較采用兩組獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以（>）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組離體心臟灌注-復(fù)跳及復(fù)跳-穩(wěn)定跳動情況離體心臟經(jīng)過缺血再灌注會導(dǎo)致心律失常，觀察結(jié)果顯示：傳統(tǒng)組離體心臟最長灌注-復(fù)跳時(shí)間5 s，最短灌注-復(fù)跳時(shí)間2 s，灌注-復(fù)跳中位時(shí)間3 s；傳統(tǒng)組離體心臟最長復(fù)跳-穩(wěn)定跳動時(shí)間8.8 min，最短復(fù)跳-穩(wěn)定跳動時(shí)間4.2 min，復(fù)跳-穩(wěn)定跳動中位時(shí)間5.05 min；改進(jìn)組離體心臟持續(xù)穩(wěn)定跳動，不存在停止灌注情況，不存在心律失常情況，與傳統(tǒng)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），離體后更好的保持了心臟功能的穩(wěn)定（表1）。

表1 兩組離體心臟灌注-復(fù)跳時(shí)間，復(fù)跳-穩(wěn)定跳動時(shí)間情況Tab.1 Heart Perfusion-Rebeat time and Rebeat-Steady beat time of two groups

2.2 兩組離體心臟存活時(shí)間心臟離體后生理功能會持續(xù)惡化，導(dǎo)致心臟生存時(shí)間有限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：改進(jìn)組離體心臟存活時(shí)間（8.55 h）顯著長于傳統(tǒng)組（5.2 h）（P＜0.001）；相比于傳統(tǒng)的心臟分離方式，改進(jìn)組對心臟功能保護(hù)和心臟生理狀態(tài)維持更具有優(yōu)勢，使離體狀態(tài)下心臟存活更長時(shí)間（圖2、表2）。

2.3 兩組冠脈流量比較離體心臟心肌代謝水平和冠脈流量密切相關(guān)，同時(shí)也反應(yīng)了冠脈通暢水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：傳統(tǒng)組離體心臟灌注后1 min內(nèi)冠脈流量為（5.17±0.94）mL/min，改進(jìn)組為（9.59±0.80）mL/min，兩組灌注后1 min 內(nèi)冠脈流量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。灌注開始前，傳統(tǒng)組心臟處于缺血、缺氧、低溫的應(yīng)激狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)觀察到傳統(tǒng)組離體心臟在灌注剛開始時(shí)，生理和代謝狀態(tài)仍處于較低的水平，表現(xiàn)為初始冠脈流量低于正常值；相比于改進(jìn)組，離體心臟經(jīng)過缺血、缺氧、低溫的打擊后，冠脈流量在30 min、1、2 h 時(shí)出現(xiàn)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并隨著時(shí)間增加冠脈流量進(jìn)一步下降（圖3、表3）。

圖2 兩組心臟存活時(shí)間比較Fig.2 Comparation of the survival time between the two groups

表2 兩組心臟存活時(shí)間Tab.2 Heart survival time of two groups h

圖3 兩組冠脈流量隨時(shí)間變化情況Fig.3 Changes of coronary flow with time in the two groups

表3 兩組不同時(shí)點(diǎn)冠脈流量情況Tab.3 Coronary flow at different time points in the two groups ±s>

表3 兩組不同時(shí)點(diǎn)冠脈流量情況Tab.3 Coronary flow at different time points in the two groups ±s>

注：與傳統(tǒng)組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.001

冠脈流量（mL/min）傳統(tǒng)組改進(jìn)組P 值1 min 5.17±0.94 9.59±0.80**＜0.001 5 min 9.61±0.81 9.64±0.86 0.834 10 min 9.21±0.82 9.65±0.77 0.097 15 min 9.18±0.83 9.61±0.79 0.080 30 min 8.76±0.85 9.56±0.83*0.047 1 h 7.99±0.67 9.36±0.78**＜0.001 2 h 7.14±0.80 9.10±0.76**＜0.001

2.4 兩組心率情況兩組心臟在離體前基礎(chǔ)心率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與傳統(tǒng)組相比，改進(jìn)組離體心臟于再灌注1、5、10、15、30 min、1 h、2 h 時(shí)的心率顯著高于傳統(tǒng)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），且心率差距隨著時(shí)間增加而增大（圖4、表4）。

2.5 兩組心律失常比較傳統(tǒng)組心臟離體方式不可避免的導(dǎo)致再灌注后心律失常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：傳統(tǒng)組離體心臟在0 ～30 min 內(nèi)的心律失常評分為（2.5 ± 1.6）分，心律失常發(fā)作總時(shí)程為（153 ±48.7）s，心律失常發(fā)生率為100%，其中心律失常類型以室早、室速為主，發(fā)生率均為100%，而室顫發(fā)生率相對較低，僅為20%。隨著離體心臟跳動時(shí)間增加，更嚴(yán)重的心律失常類型和發(fā)生頻率也隨之增加；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0 ～2 h 總評分為（3.2±1.8）分，心律失常發(fā)作總時(shí)程為（349 ± 67.1）s，室顫發(fā)生率上升至40%。與傳統(tǒng)組相比，改進(jìn)組組所有離體心臟全程均未有心律失常發(fā)生，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，表5、6）。

圖4 兩組心率隨時(shí)間變化情況（次/min）Fig.4 The changes of heart rate with time in the two group（BPM）

表4 兩組不同時(shí)間的心率情況Tab.4 Heart rate at different time in the two groups ±s>

表4 兩組不同時(shí)間的心率情況Tab.4 Heart rate at different time in the two groups ±s>

注：與傳統(tǒng)組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.001

心率（次/min）傳統(tǒng)組改進(jìn)組P 值基礎(chǔ)401.0±22.1 400.9±21.6 0.992 1 min 165.1±18.7 316.8±7.6**＜0.001 5 min 251.8±15.7 317.2±7.6**＜0.001 10 min 279.6±7.3 318.1±7.6**＜0.001 15 min 280.1±5.7 319.3±7.6**＜0.001 30 min 282.6±4.9 321.5±7.6**＜0.001 1 h 277.5±6.6 320.6±7.6**＜0.001 2 h 272.1±6.1 320.4±7.7**＜0.001

表5 兩組0 ～30 min 心律失常評分比較Tab.5 Comparison of Arrhythmia score between two groups at 0 ～30 min

表6 兩組0 ～2 h 心律失常評分比較Tab.6 Comparison of Arrhythmia score between two groups at 0 ～2 h

3 討論

Langendorff 提出的離體心臟灌注方法使心臟研究領(lǐng)域獲益100 余年，眾多研究者不斷對其進(jìn)行改進(jìn)并擴(kuò)展應(yīng)用于各類型哺乳實(shí)驗(yàn)動物，如大鼠、小鼠、兔、狗、豬等［11-15］，使之成為了近現(xiàn)代心臟研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的模型。其中應(yīng)用最為廣泛的離體心臟研究動物為大鼠，然而該模型所采用的心臟分離方法至今未有顯著改進(jìn)，應(yīng)用傳統(tǒng)的心臟分離方法不可避免的存在缺血、缺氧損傷，機(jī)械操作損傷及心律失常等問題，進(jìn)而在一定程度上影響離體后心臟生理狀態(tài)和功能。

大量研究表明心臟經(jīng)過缺血再灌注會導(dǎo)致心律失常，其機(jī)制主要涉及鈣超載［16-18］和氧自由基增加［19-21］等，避免心臟離體過程中缺血再灌注可以有效的減少心律失常的發(fā)生。從改進(jìn)組心律失常的觀測結(jié)果可以看出，未經(jīng)歷缺血再灌注的心臟在實(shí)驗(yàn)全程中均未有心律失常出現(xiàn)，這與現(xiàn)有理論相一致。傳統(tǒng)方法分離的心臟需要等待10 ～20 min 作為心臟穩(wěn)定期，才能開始實(shí)驗(yàn)，而改進(jìn)組在心臟離體后就已經(jīng)處于穩(wěn)定跳動狀態(tài)，不需要等待穩(wěn)定，可以更快開展實(shí)驗(yàn)。

相比于傳統(tǒng)組，改進(jìn)組離體心臟未經(jīng)歷過缺血再灌注，缺氧，低溫，操作損傷的離體心臟，其心率，冠脈流量均顯著提高，其反應(yīng)的就是改進(jìn)組的離體心臟具有更好的生理狀態(tài)、更高的心肌活性，酶活性及代謝水平［22-25］，心臟功能得到了最大限度的保持，生理活性更接近在體時(shí)的心臟。

本研究創(chuàng)新地改變大鼠心臟離體的手術(shù)方式，通過頸動脈插管來實(shí)現(xiàn)持續(xù)灌注狀態(tài)下分離心臟，從根本上克服了傳統(tǒng)心臟分離方式的局限性，實(shí)現(xiàn)了大鼠離體心臟模灌注模型制備技術(shù)的重大突破。

本研究的改進(jìn)心臟離體灌注方法的優(yōu)勢有：（1）心臟離體過程實(shí)現(xiàn)了持續(xù)灌注，全程無熱缺血，冷缺血，缺氧，擠壓心臟，停跳，缺血再灌注等問題。特別是對于離體心臟凋亡，自噬等研究具有重要意義。（2）復(fù)跳后心臟無心律失常，心臟功能和存活時(shí)間顯著高于經(jīng)典方法。該改進(jìn)方法同時(shí)也存在局限性，如：實(shí)現(xiàn)離體心臟持續(xù)灌注對外科手術(shù)技術(shù)要求較高，該技術(shù)學(xué)習(xí)周期相對較長等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)將在后續(xù)階段進(jìn)行左室測壓、心肌酶、分子生物學(xué)、代謝組學(xué)等方面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步完善該改進(jìn)技術(shù)的優(yōu)勢論證，簡化手術(shù)操作。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探索的改進(jìn)大鼠心臟離體灌注技術(shù)可以為心臟生理學(xué)，藥理學(xué)等研究提供更合適的離體心臟模型，以此模型開展的心臟藥理學(xué)研究可以更好的指導(dǎo)臨床藥物應(yīng)用，并且此種心臟分離方法可以廣泛應(yīng)用于心臟移植中的供體獲取與保存，為將來無損心臟獲取和保存提供新手段。